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核糖体蛋白S6(rpS6),在高等真核细胞中由249个氨基酸组成,是核糖体40S小亚基的组成成分,位于小亚基的头部,在mRNA翻译时,直接与mRNA、tRNA以及蛋白翻译起始因子结合,从而影响蛋白质的合成、细胞大小等。此外,作为早期核糖体蛋白之一,它还可以进入细胞核中,定位于核仁,参与核糖体亚单位的组装。在本研究中,使用带有EGFP标签(C端)的rpS6基因重组质粒(rpS6-1)转染的高等真核细胞HEK293以及野生型HEK293细胞进行的免疫荧光实验表明:rpS6蛋白不仅分布在细胞质中,而且还分布在核仁中。这与以前的研究报道相符。重要的是在研究过程中发现rpS6蛋白定位于核仁这一特征在整个细胞群体中存在异质性,即在细胞群体中仅有部分细胞的核仁中可检测到rpS6蛋白存在,另一部分细胞的细胞核仁中检测不到rpS6蛋白存在,推测rpS6蛋白进入核仁可能与细胞周期有关。使用rpS6-1转染的稳定细胞系进行了24h活细胞工作站观察和细胞周期阻滞实验。在使用活细胞工作站观察时,发现细胞在分裂前期(G2期)的细胞核中有较强荧光的rpS6-EGFP存在,当细胞进入分裂期(M期)时,rpS6-EGFP随着核仁的消失而消失,分裂产生的两个子细胞的细胞核中,观察不到rpS6-EGFP的存在(G1期),随着子细胞的生长,开始在细胞核中观察到rpS6-EGFP出现,并且绿色荧光强度随着时间的延长逐渐增加(G1期后期或S期)。细胞周期阻滞实验表明:当在培养基中加入过量的胸苷将细胞周期阻滞在S期时,流式细胞术检测发现S期细胞比例高达99.48％,而rpS6蛋白入核细胞比例仅为85%,S期细胞比例大于rpS6蛋白入核细胞比例,说明在所有的S期细胞群体中,有一部分细胞的细胞核中没有rpS6-EGFP蛋白,而另一部分细胞的细胞核中有rpS6-EGFP蛋白存在,提示rpS6蛋白是在S期的中期或者后期进入细胞核的,并且数量随着细胞生长逐渐增加,直至M期离开。使用秋水仙素将细胞周期阻滞在M期以及使用正常培养的细胞进行的检测结果同样也支持上述结论。 为了对rpS6蛋白在核仁中的分布进行进一步的精确定位,对rpS6-1稳定转染的HEK23细胞(使用针对EGFP蛋白和Mpp10蛋白的抗体)以及野生型HEK293细胞(使用针对rpS6蛋白和Mpp10蛋白的抗体)进行了免疫荧光双标实验。Mpp10蛋白是U3核蛋白复合体(U3RNP)的标志性蛋白,U3RNP是真核细胞核仁中的第三大核蛋白复合体,负责18SrRNA的加工成熟。结果表明:不论是rpS6-EGFP还是野生型rpS6蛋白均可与Mpp10蛋白共定位。Bernstein等的研究结果表明:在酵母细胞中,rpS6蛋白与Mpp10蛋白存在相互作用。在本研究中使用野生型HEK293细胞进行的邻位连接实验以及使用rpS6-1稳定转染的HEK293细胞进行的免疫共沉淀实验结果表明:在野生型HEK293细胞中rpS6蛋白与Mpp10蛋白共定位并且存在相互作用,在rpS6-1稳定转染的HEK293细胞中rpS6-EGFP蛋白与Mpp10蛋白共沉淀,上述结果提示:在高等真核细胞中,rpS6蛋白可能是U3RNP的一个组成成分。 在高等真核细胞中,能够进入细胞核的大分子蛋白质一般都具有核定位信号(n-uclearlocalizationsequence,NLS)。在本研究中,构建了一系列的rpS6蛋白突变体,分别为rpS6-2(1～249,Δ167～170),rpS6-3(1～249,Δ188～191),rpS6-4(1～249,Δ230～233),rpS6-5(1～249,Δ167～170,188～191,230～233),rpS6-6(SV40,1～172),rpS6-7(SV40,1～172,Δ72～98),rpS6-8(99～249),rpS6-9(99～249,Δ173～203),rpS6-10(1～249,Δ72～98,173～203),rpS6-11(1～249,S78A),rpS6-12(1～249,S148A),rpS6-13(1～249,S78A,S148A)。将这些突变体克隆入pcDNA3.1-EGFP真核表达载体中,然后将其转染入高等真核细胞HEK293。CLSM观察发现:rpS6-2、rpS6-4、rpS6-11、rpS6-12以及rpS6-13分布在每个细胞的细胞质中,核基质中没有分布,在部分细胞的核仁中可检测到这些突变体的存在,并且荧光强度从强到弱,存在异质性,与rpS6-EGFP蛋白分布情况一致;而rpS6-3、rpS6-5、rpS6-6、rpS6-7、rpS6-8、rpS6-9以及rpS6-10突变体则主要分布在整个细胞核中,细胞质中观察不到。上述结果首先表明:167KKPR170、188KRRR191、230KRRR233、1MKLNISFPATGCQKLIEVDDERKLRTFYEKRMATEVAADALGEEWKGYVVRISGGNDKQGFPMKQGVLTHGRVRLLLSKGHSCYRPRRTGERKRKSVR98以及173APKIQRLVTPRVLQHKRRRIALKKQRTK203均不是或不含rpS6蛋白的入核信号,因为rpS6-2(1～249,Δ167～170),rpS6-3(1～249,Δ188～191),rpS6-4(1～249,Δ230～233),rpS6-8(99～249),rpS6-9(99～249,Δ173～203),rpS6-10(1～249,Δ72～98,173～203)都可以进入细胞核内,推测rpS6蛋白的入核信号很可能存在于99GCIVDANLSVLNLVIVKKGEKDIPGLTDTTVPRRLGPKRASRIRKLFNLSKEDDVRQYVVRKPLNKEGKKPRTK172和204EEAAEYAKLLAKRMKEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSESSQK249段的氨基酸序列内,因为rpS6-9(99～249,Δ173～203)可以进入细胞核内。分析这两段氨基酸序列,发现在204～249段的氨基酸序列内存在两个典型的包含有4～8个碱性氨基酸的核定位信号215KR[MKEAKEKRQEQIA]KRRR233以及223KR[QEQIA]KRRR233。其次,证明了Ser78和Ser148两个潜在的磷酸化位点的磷酸化也不能影响rpS6蛋白的入核,因为rpS6-11(1～249,S78A),rpS6-12(1～249,S148A),rpS6-13(1～249,S78A,S148A)都可以进入细胞核内,最后,证明了188KRRR191和72RVRLLLSKGHSCYRPRRTGERKRKSVR98序列与rpS6蛋白在胞质中的定位有关,因为rpS6-3(1～249,Δ188～191),rpS6-5(1～249,Δ167～170,188～191,230～233),rpS6-6(SV40,1～172),rpS6-7(SV40,1～172,Δ72～98),rpS6-8(99～249),rpS6-9(99～249,Δ173～203)以及rpS6-10(1～249,Δ72～98,173～203)突变体在细胞质中均检测不到。 为了排除EGFP蛋白(238aa)的空间位阻或成熟过程对rpS6蛋白分布造成的影响,我们又构建了rpS6蛋白与HA蛋白(9aa)的融合蛋白(rpS6-14),转染HEK293细胞获得稳定转染的细胞系,使用针对HA标签的抗体进行免疫荧光实验检测rpS6蛋白在细胞内的分布,结果表明HA-rpS6蛋白与rpS6-EGFP蛋白在细胞内的分布情况一致,表明EGFP蛋白未对rpS6蛋白在细胞内的分布造成影响。 LiH和MayerC等在研究过程中发现雷帕霉素在酵母细胞中可以通过影响TOR分子与rDNA的启动子区结合或者降低RNApolymeraseI分子活性而降低酵母细胞中总rRNA的合成。高等真核细胞中,rpS6蛋白C端有5个高度保守的丝氨酸磷酸化位点,分别为Ser235、Ser236、Ser240、Ser244和Ser247,它们组成了rpS6蛋白目前研究的比较透彻的功能域。Ser235、Ser236、Ser240以及Ser244的磷酸化需要p70S6K1和p90S6K2两种蛋白激酶的联合作用,而Ser247的磷酸化则需要酪蛋白激酶1的催化。在本研究中设计了rpS6蛋白的两个突变体rpS6A和rpS6D。rpS6A是将rpS6蛋白C端的5个丝氨酸磷酸化位点全部突变为丙氨酸,该突变体可模拟去磷酸化rpS6蛋白的功能;rpS6D突变体是将rpS6蛋白C端的5个丝氨酸磷酸化位点全部突变为天冬氨酸,该突变体可模拟磷酸化rpS6蛋白的功能。当使用一种尿嘧啶核苷类似物5-ethynyluridine(EU)标记野生型HEK293细胞以及rpS6A、rpS6D稳定转染细胞,在加入雷帕霉素后新合成的RNA,然后使用Image-ProPlus软件分析新合成的RNA的量。结果表明:不论是野生型HEK293细胞,还是rpS6A和rpS6D稳定转染的细胞,在加入雷帕霉素后,细胞内新合成的总RNA量与未加雷帕霉素无明显差异(P>0.05),说明雷帕霉素并不能影响高等真核细胞中总RNA的转录。RobledoS等的研究发现,当使用siRNA干涉的方法敲除Hela细胞中rpS6蛋白表达后,最明显的特征是41S前体rRNA减少,30S前体rRNA堆积,21S前体rRNA和成熟18SrRNA减少,而成熟的28SrRNA和5.8SrRNA的含量未受影响。在条件性敲除了rpS6基因的小鼠肝脏细胞中,也观察到了34Spre-rRNA的堆积,新合成的18SrRNA则检测不到,说明rpS6蛋白对于30Spre-rRNA加工成为成熟的18SrRNA是必须的。依据HadjiolovaKV等对Hela细胞中rRNA加工成熟途径的研究结果判断,rpS6蛋白可能与pre-rRNA的A1剪切位点(3657nt)的剪切有关。上述LiH等在研究过程中发现:当在酵母细胞的培养基中加入雷帕霉素后,除可观察到25SrRNA和18SrRNA含量明显减少外,同时还观察到35Spe-rRNA和27Spe-rRNA(相当于高等真核细胞30Spre-rRNA)含量增加。雷帕霉素作为mTOR的特异性抑制剂,可以通过mTOR-S6K-S6信号通路,间接的影响rpS6蛋白C端的4个丝氨酸磷酸化(Ser235、Ser236、Ser240、Ser244)。当使用雷帕霉素抑制了rpS6A和rpS6D稳定转染细胞以及野生型HEK293细胞内源性的rpS6蛋白C端的这4个丝氨酸磷酸化后,由这5个丝氨酸磷酸化位点组成的功能域不能发挥作用。采用Northernblot的方法,使用针对前体rRNA的探针(该探针可检测47Spre-rRNA、45Spre-rRNA、30Spre-rRNA、21Spre-rRNA以及18S-Epre-rRNA),可在野生型HEK293细胞以及rpS6A稳定转染的细胞中检测到30Spre-rRNA堆积,而rpS6D稳定转染细胞中未检测到30Spre-rRNA堆积,说明rpS6蛋白C端的5个丝氨酸磷酸化位点可能是rpS6蛋白参与30Spre-rRNA加工成熟的主要功能域。