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单胃动物的高磷粪便是农业磷污染的主要来源.人们曾经尝试向饲料添加植酸酶来解决这一问题,但由于饲料加工过程会带来植酸酶活性的丧失,使得这一方法难以得到令人满意的效果,因此探索更为有效的途径已成为目前研究的一个重要课题.通过猪和禽类内源性消化道生产植酸酶成为解决单胃动物高磷粪便污染的一种新的研究策略和手段.在这一领域的研究中前人已经取得了令人振奋的成果,利用小鼠腮腺分泌蛋白基因调控区已获得在唾液中表达植酸酶的转基因小鼠和转基因猪.如果利用猪内源性的腮腺分泌蛋白基因来生产植酸酶转基因猪将有着不可比拟的优势,因此该实验拟首次采用猪内源性腮腺分泌蛋白的启动子成分与大肠杆菌(E.coli)植酸酶基因构建在唾液腺中特异高效表达的重组体,利用猪内源产生的大量植酸酶消化分解饲料中的植酸来达到解决猪排泄物中磷对环境污染的难题.腮腺分泌蛋白PSP(parotid secretory protein)是唾液中组织特异性高表达的一种蛋白,其体外功能研究表明与抗菌作用有关.利用小鼠PSP基因调控区构建的高效表达载体,证明了唾液腺作为生物反应器的巨大潜力.然后目前缺乏猪PSP基因的相关信息,因此该研究根据人、牛和鼠PSP基因的cDNA序列设计兼并引物,通过3和5RACE获得猪PSP基因全长cDNA序列.然后依据所得到的猪PSP基因cDNA序列设计引物筛选猪的BAC基因组文库,获得携带有完整猪PSP基因的BAC克隆,通过序列测定得到猪cDNA基因组基因的序列信息,并利用该基因的上、下游调控区成分开展腮腺特异性表达植酸酶基因的转基因小鼠模型的研究.该研究中所获得的猪PSP基因cDNA含有一个完整的开放阅读框,编码238个氨基酸(GenBank注册号为AY205234).用BLAST和ClustalW软件进行同源性分析,结果表明猪PSP基因与人和牛PSP基因是高度同源的.推导出的氨基酸序列与人、牛和小鼠及大鼠的同源性分别为53％、43％和32％、32％.在蛋白的二级和三级结构上,猪PSP与人PSP基因也是非常地相像.通过RT-PCR、点杂交和Northern杂交证明猪PSP基因是组织特异性表达.通过BAC文库筛选,获得含猪PSP基因的阳性克隆,测得猪PSP基因的8个外显子和7个内含子及PSP基因10kb上游调控区.经过测序得到约22kb的猪PSP基因的基因组序列(GenBank注册号为AY197556).利用RH辐射杂种板定位方法将猪PSP基因定位在猪17号染色体长臂q21-23区域.利用猪PSP基因的上游调控区、信号肽、大肠杆菌植酸酶基因和牛生长激素基因下游调控区或猪PSP基因的下游调控区构建了两个植酸酶转基因表达载体.通过显微注射注获得了植酸酶转基因小鼠,筛选出6只阳性小鼠,进行唾液中植酸酶活性检测、粪便植酸磷的检测.粪便中植酸磷检测结果表明:40号和68号阳性鼠粪便中植酸磷含量显著降低,正在进行重复验证.第二个植酸酶表达载体获得的转基因小鼠正在检测中.植酸酶转基因小鼠模型成功的建立为植酸酶环保猪的产生奠定了基础.另外,为进一步对猪PSP基因的调控区进行功能分析,又利用绿色荧光蛋白基因EGFP和猪PSP基因的上游调控区和下游调控区构建了细胞表达载体.准备做一系列的缺失载体,在猪腮腺上皮细胞中进行瞬间表达.