脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）是一种人兽共患病毒,属于微RNA病毒科心病毒属,与同科的脊髓灰质炎病毒、肠道病毒71以及柯萨奇病毒一样,是通过粪口途径传播的肠道病毒之一。EMCV具有广泛的宿主嗜性,主要感染啮齿类、猪及灵长类动物,并导致脑炎、心肌炎、生殖障碍和糖尿病等多系统疾病。本研究首先构建了基于CMV启动子的EMCV反向遗传操作系统,并以此为基础构建了衣壳蛋白VP1第152位苏氨酸突变的病毒突变体,分析了该位点在EMCV致糖尿病中的功能;同时,本研究还在EMCV感染性克隆骨架的2A基因后插入增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）外源基因,构建携带EGFP的EMCV嵌合病毒,以期为该病毒的体内外研究提供有力工具。本研究首先将猪源EMCV分离株BJC3的全长基因插入含有CMV启动子的克隆载体,构建EMCV反向遗传操作系统,并通过将重组质粒转染BHK-21细胞获得EMCV野生型拯救病毒。病毒的增殖动态学试验证实拯救病毒和亲本病毒在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性,且全基因组测序结果证实拯救病毒具有遗传稳定性。随后,通过小鼠感染模型,进一步探究了拯救病毒的神经致病性及组织噬性,结果表明拯救病毒对小鼠的神经致病性虽低于野生型亲本病毒,但仍保持了良好的体内增殖能力。研究结果证实,基于CMV启动子的EMCV感染性克隆能够高效、稳定地拯救病毒,并保持了与野生型亲本病毒相似的体内外生物学特性。早期研究认为,EMC-D株基因组第776位丙基酸是决定其是否导致小鼠病毒性糖尿病的关键毒力位点;然而,此位点相关突变能否导致嗜神经型EMCV毒株的临床表征由脑炎型转为糖尿病型尚不清楚。因此,本研究将EMCV病毒基因组第776位苏基酸突变为丙氨酸,并检测了拯救病毒EMCV-T776A在胰腺细胞系上的感染和增殖特性。结果表明,与亲本病毒EMCV-RV相比,T776A突变株在BHK-21、β-TC-6等传代细胞中均表现出相似的增殖特性,说明该位点并未改变BJC3对胰腺β细胞的体外嗜性。随后,本研究以不同剂量T776A突变病毒感染C57BL/6J和ICR两种品系小鼠,分析了丙氨酸是否为EMCV导致小鼠糖尿病的决定位点。然而,结果显示T776A攻毒小鼠的血糖水平相较于PBS处理对照虽有轻微上升,但并未达到糖尿病的判定标准,暗示该氨基酸位点并不增强嗜神经型EMCV毒株对胰腺细胞的体内嗜性。携带EGFP的EMCV嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的CMV感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得了携带EGFP的嵌合病毒。本研究通过real-time PCR、IFA及TCID50等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行了测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP基因的插入对EMCV病毒粒子的组装释放具有不良影响,并在传代过程中逐渐累积了导致EGFP功能丧失的缺失和突变。