目的：急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是一种血液系统的恶性疾病，起源于造血干细胞克隆性异常增殖，是急性髓系白血病中的一种特殊类型，其中15号染色体的PML基因和17号染色体RARa基因易位，形成特征性细胞遗传学异常t（15；17）（q22，q21），出现PML-RARa（promyelocytic leukemia/retinoic acid receptor alpha）融合基因。并证明了早幼粒细胞白血病/维甲酸受体融合基因是急性早幼粒细胞白血病发病的分子基础，该融合基因编码的融合蛋白具备一定的酪氨酸激酶活性，细胞内相关信号通路可被进一步异常激活，从而具有促进细胞异常增殖及使细胞内产生抗凋亡特性[1-4]。目前急性早幼粒细胞白血病在临床上基本是可以治愈的疾病，其是应用维甲酸（ATRA）和亚砷酸（ATO）来诱导分化治疗，可以取得80%-90%的完全缓解率，但是维甲酸的应用易发生维甲酸综合征，长期应用可发生耐药，并且部分复杂和难治性患者不能诱导缓解或缓解后易复发。雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）属于大环内酯类，本质是一种抗生素，为mTOR通路抑制剂。雷帕霉素作为免疫抑制剂，通过阻断信号转导来抑制免疫细胞的生长和增殖，抑制IL-2及其他免疫分子的合成来发挥免疫抑制作用，同时抑制移植患者IgG的产生和供着特异性免疫的发生[5-7]。因其具有强的免疫抑制已被FDA批准用于器官移植的抗排斥反应。相对于传统的免疫抑制剂，雷帕霉素具有用量小，效率高，毒副作用小尤其是肾毒性小。其在风湿免疫系统性疾病、器官移植术后降低免疫排斥反应以及对肾脏功能的修复等多类疾病治疗中均具有显著的效果。研究显示雷帕霉素不仅具有免疫抑制作用，还具有抗肿瘤的双重作用。其主要是通过抑制mTOR信号通路来抑制细胞内周期的转换，抑制细胞内DNA的复制，使细胞不能进行正常的有丝分裂，雷帕霉素可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制新生血管生成、肿瘤侵袭和抑制血管内皮增殖来发挥其抗肿瘤作用[8-13]，而且在实验研究中得到证实。目前，在临床上雷帕霉素已经应用于某些实体肿瘤的治疗，并且取得一定的疗效，实验证实雷帕霉素主要是通过抑制mTOR信号通路发挥作用，目前越来越多研究白血病的发生与信号通路的过度激活有关，因此雷帕霉素在治疗造血系统恶性肿瘤方面的作用也正在被越来越多的人关注和研究。目前在临床上，维甲酸和三氧化二砷成为治疗急性早幼粒细胞白血病一线药物，治疗效果显著，但仍存在一些问题，部分患者发生耐药的情况也越来越明显。PML-RARa融合蛋白的形成是急性早幼粒细胞白血病的发病基础，具有一定的酪氨酸激酶活性，从而使细胞分化发生阻滞，进而导致疾病的发生。因此靶向降解该融合蛋白，恢复原有基因的功能，使阻滞细胞分化成熟，这是治疗药物机制。但是，一旦患者出现过度增强的酪氨酸激酶活性，出现多药耐药基因的过度表达，白血病细胞的抗凋亡能力就会提高，降低了患者对化疗药物的反应，从而患者发生耐药。多项研究表明患者出现耐药很可能是多种发生机制的联合结果，整体过程复杂，其具体机制需要进一步研究。针对耐药的急性早幼粒细胞白血病患者，我们可以尝试研究其他新的化疗药物，为复发难治患者的治疗带来新的希望。现在多项研究表明急性早幼粒细胞白血病中的磷脂酰肌醇3激酶（phosp-hatidylinositol3kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶蛋白（targetof rapamycin，mTOR）信号通路存在异常激活，在肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化和耐药性上起重要作用。本实验是在长期研究白血病中信号转导作用机制的基础上，探讨mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素是否通过抑制mTOR靶点的活性来抑制早幼粒细胞白血病细胞株的生长，探究其作用于急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞后，对其生长增殖，凋亡和该通路下游基因与蛋白表达的生物学影响，为临床上急性早幼粒细胞白血病的治疗探索新的方法和策略。方法：1MTT方法检测不同浓度的雷帕霉素对HL-60细胞增殖的影响。2NADH细胞染色方法检测不同浓度的雷帕霉素对HL-60细胞内线粒体的影响,间接反应细胞凋亡情况。3RT-PCR检测不同浓度雷帕霉素对HL-60细胞PI3K/Akt/mTOR通路下游mRNA的影响。4Western Blot法检测不同浓度的雷帕霉素对HL-60细胞PI3K/Akt/mTOR通路下游蛋白水平上表达的影响。5统计学方法处理。结果：1不同浓度的雷帕霉素对HL-60细胞增殖情况的影响用不同浓度的雷帕霉素作用于对数期的HL-60细胞，24h后，应用MTT方法（CCK-8试剂处理）检测，结果发现雷帕霉素能够抑制HL-60细胞的增殖，20、40、80、160、320、640nmol/L雷帕霉素处理组HL-60细胞的抑制率均明显高于空白对照组（P<0.05），并且呈浓度依赖性。在此浓度范围内，随着雷帕霉素浓度的升高，HL-60细胞存活率会逐渐降低。而5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L浓度雷帕霉素作用组对HL-60细胞存活率无显著影响（P>0.05）,分析后IC50为211.9nmol/L。2不同浓度的雷帕霉素对HL-60细胞内线粒体的影响用不同浓度的雷帕霉素作用于HL-60细胞24h后，通过NADH细胞染色后发现，40、80nmol/L处理组HL-60细胞与空白对照组相比，细胞整体成团趋势减小，细胞内线粒体由月牙形变为成团块或斑块分布，局部颗粒变浅，且胞膜及核膜由开始的光滑完整出现皱缩裂口，甚至出现细胞的崩解，并且随浓度的增高，这些现象越明显。3雷帕霉素对HL-60细胞内PI3K/Akt/mTOR下游因子mRNA表达的影响用不同浓度的雷帕霉素，40nmol/L，80nmol/L，160nmol/L处理HL-60细胞24小时后，应用实时荧光定量PCR处理后结果表明，翻译起始因子elF4E结合蛋白1（4E-BP1）,核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶P70S6K,血管内皮生长因子（VEGF）,缺氧诱导因子-а(HIF-а)基因表达水平均明显低于空白对照组基因的表达量（P<0.05），而且呈浓度依耐性，随着雷帕霉素浓度增高，mRNA表达量逐渐降低（P<0.05）。4雷帕霉素对HL-60细胞内PI3K/Akt/mTOR下游因子蛋白的影响用不同浓度雷帕霉素处理HL-60细胞24小时后，浓度分别为40nmol/L，80nmol/L，160nmol/L。Western blot实验结果显示,药物处理组与空白对照组相比HL-60细胞内mTOR下游因子4E-BP1,VEGF,HIF-a蛋白表达降低（P<0.05），而且药物处理组随着雷帕霉素浓度的增加，相关蛋白的表达量逐渐降低（P<0.05）。结论1在一定浓度范围内，雷帕霉素可有效提高对HL60细胞的抑制率，并且呈浓度依赖性，浓度越高,抑制细胞增殖的能力越强。同时，雷帕霉素在一定浓度范围内可以减少线粒体的数量及影响其质量，使细胞崩解，促进HL-60细胞的凋亡。2雷帕霉素在一定浓度范围内能够使HL-60细胞内PI3K/Akt/mTOR通路下游的4E-BP1，P70S6K，VEGF，HIF-a基因表达水平减少，可以使4E-BP1，VEGF，HIF-a蛋白表达水平减少，并且呈浓度依赖性。表明雷帕霉素可能对急性早幼粒细胞白血病的治疗起一定的效果，可以尝试在难治复发的急性早幼粒细胞白血病的治疗中应用雷帕霉素，为其治疗提供新的途径，为白血病的基因治疗提供科学的理论依据。