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目的:在这项研究中,利用慢病毒转染技术下调HL-60细胞核干细胞因子(Nucleostemin,NS)的表达水平,研究核干细胞因子下调联合雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对HL-60细胞自噬与凋亡的影响,从而为下调NS联合雷帕霉素治疗急性白血病的研究奠定理论基础。方法:(1)培养HL-60细胞系,根据转染HL-60细胞的最适MOI值,用重组慢病毒感染液(NS-RNAi-GV248)感染HL-60细胞,通过荧光倒置显微镜观测转染效率和Western Blot进一步观察NS在蛋白水平下调情况。(2)采用凋亡双染流式细胞术检测沉默NS后HL-60细胞的凋亡情况;利用Western Blot在蛋白水平观察HL-60细胞沉默NS后,自噬相关蛋白LC3和p62及凋亡相关蛋白的BCL-2和Bax表达情况。(3)联合应用雷帕霉素后,采用流式细胞术测定各组HL-60细胞在24h、48h的凋亡情况;Western Blot用于检测各组HL-60细胞LC3蛋白和p62蛋白的表达情况,以及BCL-2蛋白和Bax蛋白的表达水平。(4)利用图像处理软件Image J对蛋白的条带进行灰度分析与计算。实验数据使用SPSS22.0统计分析软件进行统计分析,数据表示形式为均数±标准差((?)±s)。t检验用于两个独立样本组之间的比较;单因素方差分析用于多组独立的样本之间的比较,进一步两者之间的比较使用Bonferroni方法;P<0.05表明具有显著统计学差异。结果:(1)在最适MOI=100的条件下转染HL-60细胞,Western Blot检测结果显示敲低组HL-60细胞的NS表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)HL-60细胞的NS基因沉默后,利用流式细胞术检测,可以发现相比于空白对照组和阴性对照组,其凋亡明显增加(P<0.05);Western Blot结果显示沉默NS的HL-60细胞组,其BCL2表达增高,Bax表达减低,BCL-2/Bax比值明显减低(P<0.05);自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增高(P<0.05),P62表达水平下降(P<0.05)。(3)各组HL-60细胞经过雷帕霉素处理24h、48h后,流式细胞术检测显示,各组细胞的凋亡都明显增加,且在48h时凋亡更明显,呈现明显的时间依赖性;并且处理48h后,相比于其他任何处理组,敲低NS联合雷帕霉素组的凋亡更明显,差别具有统计学意义(P<0.05)。(4)雷帕霉素处理各组HL-60细胞48h后,Western Blot结果显示,相比于其他处理组,沉默NS结合雷帕霉素组HL-60细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著增加(P<0.05),P62蛋白相对表达下降更显著(P<0.05);各实验组的BCL-2减低,Bax增加,敲低NS联合雷帕霉素组BCL2/Bax 比值减低更明显(P<0.05)。结论:(1)沉默NS后,HL-60细胞的凋亡增加,自噬活性增强。(2)沉默NS与雷帕霉素联合可以增强HL-60细胞的自噬和凋亡。(3)沉默NS与雷帕霉素联合诱导HL-60细胞的凋亡可能与蛋白BCL-2、Bax的表达有关。