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芍药科(Paeoniaceae)芍药属（Paeonia）植物牡丹和芍药都是重要的观赏植物和药用植物，其栽培历史悠久、品种资源丰富。虽然牡丹、芍药的花色有白、绿、黄、粉红、红、紫等各种颜色，但仍然缺少蓝色、橙色等色系。牡丹品种的花色中，绝大部分品种呈紫色和紫红色（约占3/4）。芍药的花色更为单一，主要呈粉色和紫色。牡丹和芍药的紫色、紫红色花品种的花青苷(anthocyanins)组成，多以甲基化的芍药花素苷即Pn(peonidin)型花青苷为主。本文针对芍药属植物花色紫色化这一典型现象，对其花瓣中花青苷合成途径中的甲基转移酶(FOMT)进行了分析研究。 花青苷是一类重要的类黄酮化合物(flavonoids)，可赋予植物花瓣和果实丰富的色彩。牡丹和芍药紫色花中主要含有矢车菊素(cyanidin，Cy)和Pn型花青苷，然而Pn在植物体内的合成过程还不甚清楚。本研究从富含甲基化类黄酮的紫色花品种‘群芳殿’（Paeonia suffruticosa‘Gunpohden’）和甲基化类黄酮含量较低的细叶芍药（P.tenuifolia）红色花中分别克隆得到类黄酮甲基转移酶候选基因PsFOMT和PtFOMT，两者核苷酸序列相似性为98％。根据氨基酸序列比对、二级结构预测和保守性分析及系统进化树分析，推测其为Ⅱ型O-甲基转移酶(OMTs)亚类。 将候选FOMTs基因在大肠杆菌中异源表达，获得可溶的融合蛋白，并进行体外活性鉴定和酶动力学分析，发现FOMTs蛋白的甲基化催化活性对金属离子具有依赖性，在pH7.5、Mg2+存在且浓度为1.0 mM的反应体系中，其甲基化催化活性最高，经一系列类黄酮底物测试后，发现它们均可催化具有B环邻二羟基结构的类黄酮底物，最佳底物为矢车菊素糖苷，符合Ⅱ型OMTs亚类特征。但PsFOMT和PtFOMT的催化活性存在很大差异，PsFOMT的甲基化酶活性约为PtFOMT的60倍。为进一步分析造成两者酶活性差异的原因，我们将PsFOMT与PtFOMT推定氨基酸序列的4个差异位点进行突变分析，经过对正向和反向突变FOMTs蛋白的甲基化酶活分析，发现87位单个氨基酸的突变对于甲基化活性差异起到关键作用。同时，参照已知蛋白晶体结构3C3Y_A，对PsFOMT与PtFOMT蛋白的三维结构进行模拟，分析预测了该位点引起酶催化活性变化的原因。 为研究PsFOMT和PtFOMT基因在植物体内的功能，通过农杆菌介导叶盘法将其转入烟草，在后代阳性株系中分析花青苷的化学组成，发现与只含Cy型花青苷的对照相比，35S∷PsFOMT株系花瓣中合成了大量的Pn型花青苷，而35S∷PtFOMT株系的花瓣中只有少量Pn型花青苷。体内表达实验证明了PsFOMT和PtFOMT基因在植物体内的甲基化功能，也验证了其活性的差异。同时，农杆菌介导瞬时转化草莓果实实验也得到了相似的实验结果。 为探索类黄酮甲基转移酶对牡丹和芍药紫色花形成的影响，利用荧光定量PCR技术对PsFOMT和PtFOMT基因在不同发育阶段的花瓣和根茎叶中的表达情况进行分析，其主要在花瓣中表达，且PsFOMT在不同发育阶段的表达量与花瓣中Pn型花青苷的积累趋势一致，而与其它类黄酮化合物无明显关联，表明PsFOMT在花青苷甲基化过程中发挥主要作用。通过调查35S∷PsFOMT株系转基因烟草花色变化，过表达PsFOMT的烟草花色显著向紫色偏移。结合牡丹花色及类黄酮组成分析揭示了甲基化导致牡丹花色的紫色化。而在细叶芍药中，虽然PtFOMT基因的表达模式与PsFOMT一致，但因为其甲基化催化能力弱，细叶芍药中的花青苷多为Cy型糖苷，故花色呈现鲜红色。芍药属其它5个紫色花品种的FOMT基因序列、花青苷类型和色彩参数分析结果也支持了这一结果。 本研究阐述了芍药属植物花青苷合成的下游甲基化修饰途径，探讨了牡丹花紫色化的分子机制，为牡丹花色调控和花色育种开辟了一条新途径。