椪柑（Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan）,是芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）植物。椪柑果实营养丰富,含有大量的次生代谢产物,如类黄酮、多酚、类胡萝卜素等,其中,类黄酮具有广泛的生物学功能及生理活性,一直是人们关注的焦点。O-甲基化是柑橘类黄酮一种常见的化学修饰,是其结构及功能多样性的基础。类黄酮的O-甲基化修饰是在O-甲基转移酶（OMT,O-methyltransferase）催化下,将S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM,S-adenosyl-L-methionine）的甲基基团（-CH3）转移到底物类黄酮上,生成O-甲基化类黄酮和S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH,S-adenosyl-L-homocysteine）的过程。研究证实,O-甲基化修饰可以提高类黄酮对脂类和蛋白的亲和性,进而扩大类黄酮在细胞中的分布范围,更有利于其在植物的根瘤固氮、吸引昆虫传粉等生长发育进程及抗虫、抗病、抗杂草等抗逆反应中发挥作用。除此之外,O-甲基化修饰还能够提高类黄酮在人体中的口服利用率,从而产生更强的抗氧化、抗炎症、抗癌、抗菌、抗病毒和保护心脑血管及神经系统等的功效。近年来,O-甲基化类黄酮及相关的O-甲基转移酶逐渐成为研究的热点,大量植物OMT基因被发现,但相关功能研究较少。本研究以椪柑（新生系3号）的幼叶、花、花后20 d幼果、花后40 d幼果为实验材料,通过转录组测序,对相关基因进行功能注释,筛选出椪柑中高表达的O-甲基转移酶候选基因（CrOMTs）,结合进化聚类对基因相关功能进行预测分析。随后,从筛选出的高表达CrOMT基因中,克隆得到11个CrOMT基因,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。最后,通过原核表达及体外酶活检测对CrOMT基因的功能进行验证。本研究取得的主要结果如下:1.通过转录组测序,对相关基因进行功能注释,共获得17194个注释结果,最终筛选到29个高表达的CrOMT候选基因。基于进化聚类分析,将29个CrOMT分为两个功能聚类群,其中24个CrOMT归为第一聚类（Cluster I）,属于咖啡酸O-甲基转移酶（COMT,caffeic acid O-methyltransferase）亚家族,在该聚类中,推测某些CrOMT具有类似催化类黄酮的甲基化修饰功能。剩余5个CrOMT归为第二聚类（Cluster II）,属于咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶（CCo AOMT,caffeoyl Co A O-methyltransferase）亚家族,在该聚类中,推测某些CrOMT具有类似催化咖啡酰辅酶A的甲基化修饰功能。2.利用PCR扩增技术,克隆得到11个CrOMT候选基因的c DNA序列,序列长度介于948-1101 bp之间。通过一系列生物信息学分析,这11个CrOMT编码氨基酸数目介于315-366之间,蛋白分子量介于35.09-40.80 k Da之间,理论等电点介于5.27-5.86之间,均属于酸性蛋白。9个CrOMT的不稳定系数<40,属于稳定蛋白,其余2个为不稳定蛋白;5个CrOMT的GRAVY值<0,预测为亲水性蛋白,其余6个为疏水性蛋白。亚细胞定位显示,11个CrOMT可能定位于细胞质。3.选取了pCold TF及pMAL-c2X两种原核表达载体,构建了pCold TF-CrOMT和pMAL-c2X-CrOMT重组质粒,并分别转化至大肠杆菌BL21 Star（DE3）和Rosetta（DE3）中。通过探索重组蛋白表达的诱导条件发现,pCold TF-CrOMT重组蛋白的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.1 m M、诱导温度15℃、诱导时间8 h;pMAL-c2X-CrOMT重组蛋白的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.1 m M、诱导温度37℃、诱导时间6 h。经SDS-PAGE电泳检测发现,CrOMT4、CrOMT6、CrOMT7和CrOMT27能够可溶性表达。4.对4个重组蛋白进行体外酶活检测,结果显示,CrOMT4重组蛋白酶的最适底物为黄酮醇类的槲皮素,特异性催化位点为3’-OH;CrOMT6和CrOMT7重组蛋白酶的最适底物为黄酮类的木犀草素,特异性催化位点为3’-OH和5’-OH;CrOMT27不具有催化活性。酶动力学分析表明,CrOMT4催化的最适温度为37℃、最适p H为8.0;CrOMT6和CrOMT7催化的最适温度为38.5℃、最适p H为7.5。整体上,CrOMT6和CrOMT7的催化效率高于CrOMT4。