球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是目前世界上研究和使用最广泛的昆虫病原真菌之一。在害虫的生物防治中,球孢白僵菌施用后会宿存在土壤中,并不可避免的与蚯蚓,尤其是表层种蚯蚓发生接触。那么,蚯蚓的活动、取食及其表皮粘液会对球孢白僵菌的活性产生什么样的影响呢?本研究利用表层种蚯蚓赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）、球孢白僵菌（B.bassiana）TST05菌株和核桃举肢蛾（Atrijuglans hetaohei）老熟幼虫,评估了蚯蚓对球孢白僵菌的影响,包括对球孢白僵菌在土壤中的分布、活力和对昆虫致病性的影响。通过观察球孢白僵菌TST05在土壤中的分布、生物量、扫描电镜下的孢子形态,以及检测其孢子萌发率、胞外酶活性以及对核桃举肢蛾的感染试验。结果发现,蚯蚓的活动和取食能够促进球孢白僵菌的向下扩散,但却减少了活孢子的数量。蚯蚓的中肠液对白僵菌孢子萌发有明显抑制作用。球孢白僵菌经蚯蚓肠道排泄后,对昆虫仍有致病性。附着在蚯蚓表皮上的白僵菌孢子,会被表皮粘液所覆盖,变得粗糙、萎缩。经表皮粘液处理后,球孢白僵菌孢子萌发率和胞外酶活性均受到明显抑制。将球孢白僵菌和粘液的混合物接种在核桃举肢蛾老熟幼虫后发现,粘液可以降低球孢白僵菌对昆虫的致病性,从而减缓病程,降低死亡率。结果表明,蚯蚓的活动和取食促进了球孢白僵菌在土壤中的分布,但降低了球孢白僵菌活孢子的数量。蚯蚓的表皮粘液可以抑制球孢白僵菌的活性,及其对目标昆虫的传染性和致病性。然而,经表皮粘液处理后,存活的球孢白僵菌对昆虫仍有一定的致病性。本研究对了解蚯蚓与土壤中球孢白僵菌的相互作用,指导球孢白僵菌在害虫生物防治中的科学应用具有重要意义。研究结果如下:1.经球孢白僵菌处理后的蚯蚓表皮及肠道进行了超微结构观察,实验结果表明,经球孢白僵菌处理后,蚯蚓表皮超微结构发生了明显改变,表皮角质层增厚,表皮上的分泌细胞直径增加,分泌泡膨大,分泌颗粒增多。蚯蚓前肠细胞中,线粒体数量增加,并且观察到了线粒体空泡。蚯蚓中肠内纤毛加粗,数量增加。中肠细胞中,线粒体、核糖体数量增加。而蚯蚓后肠细胞与对照组相比无明显差异。2.本试验采用有四层结构的土壤柱,研究蚯蚓活动对球孢白僵菌在土壤中分布的影响。结果发现,在没有蚯蚓活动的对照组中,接种到土壤表面的球孢白僵菌孢子没有明显的向下扩散。孢子仍主要停留在土壤柱的第一层,第二层检出的孢子数量极少,未扩散到第三、第四层。而在添加了蚯蚓的处理组中,球孢白僵菌孢子在土壤柱中的分布发生了显著的变化。从第一到第四层土壤样本中均分离培养出了球孢白僵菌菌落。这说明蚯蚓的活动已经使原来接种在土壤柱表层的球孢白僵菌孢子,向下扩散到了土壤柱的第四层。此外,试验结果还显示,从蚯蚓活动的处理组土壤中,分离出的白僵菌菌落总数,与对照组相比减少了约80%。说明蚯蚓的活动一方面促进了白僵菌在土壤中的向下扩散,另一方面又减少了具有活性的白僵菌孢子的数量。3.本研究测定了赤子爱胜蚓的前肠内容物、中肠内容物,以及蚓粪中球孢白僵菌的菌落数。结果显示,经过蚯蚓消化道后,还有部分球孢白僵菌能存活下来,可以随着蚯蚓在土壤中的活动和排泄被携带和扩散。但同时发现,这个过程中有活性的白僵菌孢子总数会明显减少。显著的变化发生在中肠和蚓粪中,从中肠内容物样本检出的孢子数比土壤样本的减少了将近一半,在蚓粪样本中检出孢子只有土壤样本的14.2%。这可能是经过蚯蚓肠道后,一部分孢子被蚯蚓消化的结果。因此本试验采用蚯蚓的中肠消化液检测其对球孢白僵菌孢子萌发和菌落生长的抑制作用,结果显示其抑制作用十分明显,与对照组相比减少了91%,差异极显著,说明蚯蚓肠液对球孢白僵菌的孢子萌发有很强的抑制作用。4.为了验证蚯蚓肠道消化对球孢白僵菌致病力的影响,用赤子爱胜蚓的蚓粪中的球孢白僵菌与土壤中的球孢白僵菌（CK组）分别侵染核桃举肢蛾幼虫。结果发现,两组幼虫染病过程和症状相似,致死率和致死中时差异不显著。由此推测,经过蚯蚓肠道消化后,虽然白僵菌孢子数会显著减少,但在蚓粪中依然存活的白僵菌孢子,对靶标昆虫仍然具有较强感染力。5.本研究采用浸渍法给蚯蚓染菌,经扫描电镜观察,发现球孢白僵菌的孢子可以在蚯蚓身体表面附着,但是一直没有发现有孢子萌发和侵入蚯蚓体壁的现象。球孢白僵菌孢子会附着在蚯蚓表皮的凹陷处,也可附着在节间沟和气孔周围。最初附着在蚯蚓表皮的白僵菌孢子表面光滑、圆润、饱满。随着时间的延长,白僵菌孢子会被蚯蚓分泌的体表粘液所包被,使孢子表面显得粗糙和凹凸不平,最后皱缩和干瘪,不能萌发。这说明球孢白僵菌孢子虽然可以附着到蚯蚓体表,但蚯蚓体表粘液对孢子能很快形成包裹,阻止了孢子的萌发和后续的入侵。由此也可以看出,体表粘液是蚯蚓防御病原菌入侵的第一道屏障。6.本研究提取蚯蚓体表粘液,配制成5种浓度的粘液溶液,用来处理白僵菌孢子,以观察它对白僵菌孢子萌发和菌落生长的影响。结果显示,蚯蚓粘液处理会对球孢白僵菌的萌发和菌落生长产生了显著的抑制作用,并且浓度越大,抑制作用越强。7.在球孢白僵菌侵入昆虫体表的过程中,其分泌的胞外酶对昆虫表皮的降解起着重要作用。球孢白僵菌胞外酶的活性通常被认为是检测其对寄主昆虫传染性的重要指标。在本研究中,每天向处理组EW液体培养基中添加蚯蚓表皮粘液冻干粉,而处理组E0仅在接种时添加一次蚯蚓表皮粘液冻干粉,而对照组不添加蚯蚓表皮粘液冻干粉。发现在球孢白僵菌的萌发过程中,蚯蚓表皮粘液对4种真菌胞外酶（枯草杆菌蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶和NAG酶）具有显著的抑制作用,并且抑制作用可以持续一段时间。结果表明,蚯蚓表皮粘液可以抑制胞外酶的分泌。然而,如果球孢白僵菌不再接触新分泌的蚯蚓表皮粘液,抑制作用将逐渐减弱。8.为了验证蚯蚓粘液是否对球孢白僵菌的致病性具有影响,本研究用蚯蚓表皮粘液处理过的球孢白僵菌孢子接种在核桃举肢蛾老熟幼虫上。结果表明,蚯蚓表皮粘液能降低球孢白僵菌对昆虫的致病性,导致感染期间幼虫的病程变慢,死亡率降低。尽管白僵菌对核桃举肢蛾幼虫的致病性受到蚯蚓表皮粘液的影响,但用蚯蚓表皮粘液处理后存活下来的球孢白僵菌孢子对昆虫仍保持一定的感染性。此外,随着蚯蚓表皮粘液中活性成分的丧失,5-7天后蚯蚓表皮粘液对球孢白僵菌的抑制作用会逐渐减弱。9.为了阐明白僵菌是否对蚯蚓表皮的天然免疫产生影响,从转录组数据中筛选了与蚯蚓表皮粘液分泌及抗菌作用相关的DEGs,发现多种与天然免疫有关的基因发生了差异性表达,表明这些基因在蚯蚓中过度表达可能是对白僵菌附着的一种积极反应,与其复杂的免疫机制有关。