乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,而转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因,肺组织是乳腺癌最常见的转移靶器官之一。肿瘤转移一旦发生,现有的治疗方法很难产生持久的临床疗效。因此,早期发现并干预肿瘤转移的发生具有重要的临床意义。“种子与土壤”学说是近年来肿瘤转移研究中的一个重要理论基础。该学说认为,肿瘤转移的发生需要肿瘤细胞（即种子）和转移靶器官微环境（即土壤）之间的相互作用和共同参与。肿瘤转移是由一系列复杂而又相互关联的过程组成,主要可以分为两个阶段:转移前阶段和转移阶段。在循环肿瘤细胞到达转移靶器官之前,原发性肿瘤可以选择性地改变远处器官如肺、肝、脑、和淋巴结等处的微环境,以促进转移。这种远处器官的支持性转移微环境被称为“预转移小生境”（pre-metastatic niche）。其特征是血管通透性增加、细胞外基质重塑、骨髓源性细胞募集、血管生成和免疫抑制等。近年来,参与预转移小生境形成的细胞、因子等逐渐成为治疗肿瘤转移的靶点。肿瘤的转移阶段即肿瘤细胞从原发肿瘤脱落,沿着血液和淋巴循环到达预先发生了改变的靶器官,并在此处渗出、定植和生长的过程。这两个阶段在肿瘤转移中都发挥着重要作用。肿瘤相关性巨噬细胞（Tumorassociated macrophages,TAMs）是肿瘤微环境中含量最多的炎性细胞之一,主要来源于外周血循环的单核细胞,并在肿瘤微环境中不同细胞、因子的影响下分化为具有不同功能的亚型。近年来许多研究表明TAMs在促进肿瘤转移的整个级联过程中都发挥着重要的作用,因此也为抑制肿瘤的转移和进展提供了相应的治疗靶点。在原发肿瘤部位巨噬细胞可以通过多种机制促进肿瘤细胞的恶性侵袭和迁移能力,增加恶性肿瘤细胞的转移潜能。除此之外,远处转移部位的巨噬细胞也参与了肿瘤转移过程的进展,它们不仅可以在肿瘤细胞到达转移部位之前就提前募集到转移灶,改善转移器官内的微环境,还能够直接作用于肿瘤细胞促进其在转移部位的渗出、定植及生长。因此巨噬细胞在肿瘤转移中的作用受到越来越多关注,但它在肿瘤转移这两个阶段中发挥的具体作用和机制仍不清楚。本研究分为两个部分,第一部利用4T1模型研究了乳腺癌转移肺组织中巨噬细胞的募集及分化以及它在促进转移前肺组织基质重塑中的作用机制。第二部分探讨了巨噬细胞在促进乳腺癌细胞恶性转移潜能中的作用机制。本研究旨在寻找巨噬细胞在促进乳腺癌肺转移中的潜在分子和机制,从而可以通过阻断巨噬细胞的募集和它在促瘤效应中发挥作用的分子来防治肿瘤的转移。第一部分:巨噬细胞促进乳腺癌转移前期肺组织内基质重塑的机制研究。研究目的:1.构建4T1原位乳腺癌肺组织模型,检测转移前肺组织中巨噬细胞的募集和分化。2.探究巨噬细胞参与调控转移前肺组织内基质重塑的作用机制。研究方法:1.原发乳腺癌促进转移前期肺组织内巨噬细胞的募集和分化。1.1乳腺癌肺转移模型的建立:将4T1乳腺癌细胞注射于6-8周龄雌性BALB/c小鼠的第四对乳腺处。1.2 HE染色观察原发乳腺癌对肺组织内炎症反应的影响。1.3免疫荧光及western blot检测原发乳腺癌对转移前肺组织内F4/80+巨噬细胞数量和蛋白表达的影响。1.4 Transwell实验检测乳腺癌细胞条件培养基对巨噬细胞迁移能力的影响,细胞粘附实验检测对巨噬细胞分化能力的影响。1.5用肿瘤细胞培养基将巨噬细胞进一步诱导“教育”成活化的肿瘤相关性巨噬细胞（TAMs）。2.巨噬细胞通过分泌S100A4促进转移前肺组织中基质的重塑。2.1免疫荧光、免疫组化及western blot检测转移前肺组织中活化成纤维细胞标志蛋白α-smooth muscle actin（α-SMA）和细胞外基质蛋白fibronectin的表达。2.2体内实验中,尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体（Clodronate liposomes,CL）清除荷瘤小鼠体内巨噬细胞后,检测对肺组织内成纤维细胞活化和肺内转移瘤的影响。2.3体外实验中,将活化的TAMs与正常肺成纤维细胞共培养,检测对成纤维细胞激活和迁移能力的影响。2.4免疫荧光双染检测转移前肺组织中S100A4的表达和细胞来源。2.5敲低巨噬细胞内S100A4后再将两者共培养,western blot检测其对正常肺成纤维细胞活化标志蛋白α-SMA和Fibronectin的影响。2.6进一步用外源性S100A4蛋白刺激正常成纤维细胞,检测其对成纤维细胞活化和迁移等表型的影响。2.7Western blot检测S100A4处理成纤维细胞后细胞内ERK,Wnt,FAK信通路的变化。研究结果:1.原发乳腺癌促进转移前肺组织内巨噬细胞的募集和分化。1.1 HE染色结果显示,与对照组相比,4T1转移模型小鼠的肺组织中可以看到大量炎性细胞浸润,并且炎症反应随着肿瘤转移的进展而不断加重。进一步的免疫荧光和组化染色证实,转移前肺组织内浸润的炎症细胞中含有大量巨噬细胞。Western blot也证实了荷瘤小鼠转移前肺组织中F4/80蛋白的表达增多。1.2在体外实验中,Transwell实验结果显示:与对照组培养基相比,乳腺癌细胞的条件培养基能明显促进巨噬细胞的迁移能力。1.3细胞粘附实验证实:乳腺癌细胞条件培养基可以促进单核细胞THP-1分化为巨噬细胞的能力。1.4乳腺癌细胞条件培养基可以诱导TAMs体外模型的形成,并且倾向于表达M2型巨噬细胞的分子表型。2.巨噬细胞通过分泌S100A4促进转移前肺组织中基质的重塑。2.1在预转移阶段肺组织中,活化的α-SMA+成纤维细胞及细胞外基质蛋白fibronectin表达增多。2.2体内实验中,清除荷瘤小鼠体内巨噬细胞后,小鼠肺组织内活化的成纤维细胞也相应减少,肺转移瘤的负荷和数量也减少。2.3体外实验中TAMs可以促进正常成纤维细胞的活化和迁移。2.4转移前肺组织中S100A4表达增多并定位分布于巨噬细胞及其周围。2.5敲减巨噬细胞内S100A4可以抑制它对成纤维细胞的激活作用。2.6外源性S100A4蛋白处理正常成纤维细胞,可以促进其活化和迁移等表型的增强。2.7外源性S100A4蛋白处理小鼠成纤维细胞可以诱导ERK信号通路的活跃表达。ERK抑制剂可以抑制成纤维细胞活化蛋白的表达。表明S100A4可以通过ERK信号通路来促进成纤维细胞的活化。研究结论:1.原发乳腺癌可以促进巨噬细胞聚集在转移前肺组织内。2.巨噬细胞分泌的S100A4通过激活ERK通路促进转移前肺组织中基质的重塑。第二部分:巨噬细胞促进乳腺癌细胞恶性转移潜能的分子机制研究。研究目的:探究肿瘤相关性巨噬细胞（TAMs）参与乳腺癌恶性侵袭、迁移和EMT调控中的作用分子和机制。研究方法:1.TAMs促进乳腺癌侵袭、迁移及EMT能力。1.1肿瘤细胞培养基诱导THP-1细胞形成肿瘤相关性巨噬细胞（TAMs）。1.2体外共培养肿瘤相关性巨噬细胞和乳腺癌细胞,检测乳腺癌细胞形态学的改变。1.3 Transwell检测共培养体系内TAMs对乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。1.4体外共培养后real-time PCR检测乳腺癌细胞内EMT相关转录因子的表达,western blot检测EMT常见标志蛋白的表达。1.5使用氯膦酸盐脂质体尾静脉注射清除4T1小鼠体内巨噬细胞后,检测对小鼠原位乳腺肿瘤和肺转移瘤生长的影响。免疫组化检测肿瘤组织内EMT相关蛋白的表达。2.TAMs分泌的IL6通过上调TGM2基因的表达促进乳腺癌侵袭、迁移及EMT能力。2.1 Real-time PCR及Elisa检测TAMs分泌的与肿瘤EMT和转移相关的炎性、趋化因子。2.2加IL6处理后检测对乳腺癌细胞迁移、侵袭和EMT的影响。2.3 Real-time PCR及western blot检测IL6刺激对乳腺癌细胞TGM2表达的影响。2.4 Transwell及western blot检测TGM2基因的过表达和敲除对乳腺癌细胞侵袭、迁移和EMT的影响。3.IL6通过JAK2/STAT3通路上调TGM2基因的表达。3.1 Western blot检测TAMs和IL6处理后乳腺癌细胞内信号通路的激活。3.2加入AG490通路抑制剂后western blot检测乳腺癌细胞内TGM2的表达。3.3双荧光素酶试验检测STAT3对TGM2基因的转录激活作用。研究结果1.TAMs促进乳腺癌细胞侵袭、迁移及EMT能力。1.1与TAMs共培养后,乳腺癌细胞形态发生改变,细胞之间的紧密连接变疏松。1.2与TAMs共培养组的乳腺癌细胞恶性侵袭、迁移能力增强。1.3 Real-time PCR及western blot检测发现TAMs可以促进乳腺癌细胞内EMT相关转录因子及蛋白的表达。1.4体内实验中发现TAMs可以促进原位乳腺肿瘤和肺转移瘤的生长。2.TAMs分泌的IL6通过上调TGM2基因的表达促进乳腺癌侵袭、迁移及EMT能力。2.1 Real-time PCR及Elisa检测发现:TAMs分泌的IL6明显增多。2.2外源性IL6因子处理后可以增强乳腺癌细胞的侵袭、迁移和EMT能力,而IL6的中和性抗体则抑制了 TAMs对乳腺癌细胞的上述作用。2.3 TAMs和IL6处理均能刺激乳腺癌细胞内促癌基因TGM2的表达。2.4过表达TGM2能促进乳腺癌细胞的侵袭、迁移和EMT。2.5敲除TGM2基因可以抑制TAMs对乳腺癌的促迁移、侵袭能力。3.IL6通过JAK2/STAT3信号通路激活TGM2转录表达。3.1 TAMs分泌的IL6可以激活乳腺癌细胞内的JAK2/STAT3通路。3.2 JAK2/STAT3通路抑制剂AG490抑制了乳腺癌细胞内TGM2的表达。3.3 STAT3转录因子可以直接结合于TGM2的启动子区,促进TGM2基因的表达。研究结论:TAMs来源的IL6可以通过JAK2/STAT3通路上调乳腺癌细胞内促癌基因TGM2的表达,促进肿瘤细胞的恶性转移潜能。