Dravet综合征（Dravet syndrome,DS）是婴幼儿期起病的一种罕见且严重的发育和癫痫性脑病（Developmental and epileptic encephalopathy,DEE）。热性惊厥（Febrile seizures,FS）或热诱发性癫痫和全面性神经系统发育障碍是DS最特征性的两大类临床表征。SCN1A基因与DS之间存在高度特异,SCN1A基因编码翻译SCN1A蛋白即Na V1.1通道,其突变是导致DS的最主要原因,由于其属于遗传性癫痫脑病且临床罕见,目前尚无完全有效的治疗方案,预后极差,给家庭和社会带来沉重的经济负担。岛叶与癫痫之间关系密切,“岛叶癫痫”的概念早已经被学术界广泛接受,已成为癫痫研究领域的热门课题。岛叶作为致痫的起源（独立致痫）和癫痫的传播路径（灶性复合体）,是癫痫的重要结构和功能单位。岛叶也参与认知的控制,与学习及记忆等认知功能有关,被认为是认知控制的“瓶颈”。课题组前期的试验发现,反复给予大鼠岛叶皮层阈下电刺激可诱发癫痫的发生,且刺激岛叶皮层比传统的杏仁核电点燃癫痫模型更易点燃。我们之前也还发现岛叶参与学习、记忆及记忆再巩固等认知行为的形成。近年来对于不同脑区与DS之间的关系备受关注。已有研究表明DS的临床表型（如热敏性癫痫或自发性癫痫,认知功能障碍）与大脑的某些区域（如海马及前脑基底部）存在特定关系。但对于岛叶在DS中的作用目前尚未被研究和阐述。基于以上理论,我们提出假说:岛叶皮层可能在DS中起到重要作用,即岛叶Scn1a敲低所导致的Na V1.1通道功能丧失参与了DS癫痫的发生及所伴发的认知等功能改变。鉴于此,本研究首先应用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）腺病毒载体系统使用立体定向注射技术构建岛叶Scn1a敲低（Knock down）DS小鼠模型,然后通过热诱导加热系统及电生理观察模型鼠的癫痫行为学及脑皮层电活动特征,并应用Smart 3.0行为学系统检测并评估模型鼠的记忆、认知、焦虑等行为学特征,最后我们选择在系统性Scn1a敲除（Knock out,KO）的经典DS模型小鼠上取岛叶皮层进行蛋白组学分析并通过PRM（parallel response monitoring,PRM）进行蛋白验证,以更进一步精准探讨岛叶Scn1a基因在DS中的可能发生机制,为DS这一难治性癫痫脑病,提供新的治疗线索和靶点,为临床诊疗提供理论指导依据。第一部分岛叶皮层Scn1a敲低Dravet综合征小鼠模型的构建目的通过小干扰RNA腺病毒载体系统构建岛叶Scn1a敲低DS小鼠模型。方法采用立体定位注射技术将Scn1a干扰腺病毒载体（Ad-Scn1a-si RNA）及无义空载腺病毒（Ad-Scn1a-Δsi RNA）分别定位注射至P28天大的C57/BL6J小鼠双侧岛叶皮层,以构建岛叶Scn1a敲低小鼠DS模型。7天后通过免疫荧光染色及Western-blot来检测SCN1A蛋白表达情况。使用热诱导加热系统对造模小鼠进行加热,观察并记录各组癫痫发作行为学情况,并用脑电图评估小鼠大脑皮层电活动变化。结果:免疫荧光结果提示岛叶皮层注射Scn1a干扰腺病毒可以有效减少SCN1A蛋白的表达,Ad-Scn1a-si RNA组小鼠较Ad-Scn1a-Δsi RNA组小鼠荧光光密度明显降低（p＜0.0001）。Western blot结果显示Ad-Scn1a-si RNA腺病毒明显抑制SCN1A蛋白的表达（p＜0.0001）。热诱导条件下随着小鼠核心温度的升高癫痫发作率越来越高至56.6%,无癫痫发作率也逐渐降低至43.4%。小鼠出现4级以上癫痫发作的平均温度为41.5±0.2℃。脑电图监测结果显示Ad-Scn1a-Δsi RNA小鼠脑电图在加热期与适应期无明显差异,而AdScn1a-si RNA小鼠在适应期与Ad-Scn1a-Δsi RNA脑电图基本相似,但在加热期可见大量的高-尖棘波的癫痫出现,并且在癫痫大发作的间期也可见少量单发的高-尖波出现。结论:1.岛叶皮层Scn1a敲低DS小鼠模型构建成功。2.局部岛叶皮层Scn1a缺失可导致热诱发癫痫或热性惊厥的发生。第二部分岛叶Scn1a敲低对小鼠认知等行为学的影响目的探究岛叶皮层Scn1a敲低对小鼠认知、焦虑、社会交互等功能的影响。方法岛叶皮层Scn1a敲低小鼠模型（Ad-Scn1a-si RNA组）和对照组（Ad-Scn1a-Δsi RNA组）构建成功后,将两组模型小鼠分别进行认知、焦虑、自闭症样等行为学试验包括旷场试验、高架十字迷宫试验、新物体识别试验、三箱交互试验、水迷宫试验及穿梭箱试验。通过Nissl染色法及Neu N/GFAP免疫荧光双染来分析海马神经元及胶质细胞的是否存在损伤,以判定可能存在的认知等功能障碍是与癫痫引起的继发性海马损伤有关还是与原发性岛叶皮层Scn1a缺失有关。结果:1.在水迷宫（MWM）定位航行实验中发现Ad-Scn1a-si RNA组小鼠的逃避潜伏期明显长于Ad-Scn1a-Δsi RNA组（P＜0.001）。与Ad-Scn1a-Δsi RNA组相比,Ad-Scn1a-si RNA组中的小鼠必须游更长的距离才能到达隐藏平台（P＜0.05）。在MWM的空间探索实验中,Ad-Scn1a-si RNA组小鼠穿越目标象限的时间以及60秒内在目标象限中花费的时间也显著低于Ad-Scn1a-Δsi RNA组（P＜0.05）;而在新物体识别（NOR）实验中两组小鼠接触新物体的时间却无明显差异（P＞0.05）;在穿梭箱实验中（SB）Ad-Scn1a-si RNA组小鼠的主动逃避次明显少于Ad-Scn1a-Δsi RNA组小鼠（P＜0.001）;2.我们用旷场试验和高架十字迷宫试验评估岛叶Scn1a敲低是否导致小鼠焦虑样行为的改变。在旷场试验中两组小鼠在总的移动距离,中央区逗留的时间（s）及穿梭的次数均无明显差异（P＞0.05）。和旷场试验结果完全相反高架十字迷宫试验中Ad-Scn1asi RNA组小鼠在开放臂中停留的时间和次数均显著低于Ad-Scn1a-Δsi RNA组小鼠。3.在三箱交互实验中发现两组小鼠表现出更加“愿意”与Stranger 1接触而不喜欢放置于对角处空笼,两组小鼠对Stranger 1接触时间较空笼相比均有显著性差异（p＜0.05）,但是在放置Stranger2后Ad-Scn1a-Δsi RNA组小鼠与Stranger2接触时间与AdScn1a-si RNA组小鼠无明显差异（P＞0.05）。4.Nissal染色示显示海马CA1、CA3及DG区均未见神经元的显著丢失,AdScn1a-si RNA组及Ad-Scn1a-Δsi RNA组小鼠尼氏体数量均无明显统计学差异（P＞0.05）。5.免疫荧光显示与Ad-Scn1a-Δsi RNA组小鼠相比,Ad-Scn1a-si RNA组小鼠海马区（CA1、CA3及DG区）Neun表达无明显差异,即海马神经元数量并未明显减少（P＞0.05）,GFAP荧光强度在两组小鼠的海马各区也未见显著差异,即海马区星形胶质细胞也未受到损伤（P＞0.05）。结论:1.岛叶Scn1a敲低小鼠可导致DS的两个合并症即认知功能障碍及焦虑样表现,但是不引起社会交互障碍。2.岛叶Scn1a敲低DS小鼠模型的认知功能障碍及焦虑样表现与继发性海马损伤无关,而与原发性岛叶Nav1.1钠通道的功能缺失关系密切。第三部分岛叶Scn1a基因在Dravet综合征中的机制研究目的该部分旨在系统性Scn1a基因敲除鼠上深入探究岛叶在Dravet综合征中的可能发生机制。方法构建Scn1a基因敲除的Dravet综合征（Scn1a+/-KO）小鼠模型。试验分为野生组（WT）和KO组两组。1.小鼠的繁育及鉴定:首先繁殖并鉴定出KO和WT小鼠。2.将鉴定出5周龄大的WT和KO组小鼠进行热诱导,记录各小鼠的癫痫行为学表现及脑电活动情况。3.随机从两组小鼠中抽取KO和WT小鼠各三只解剖分离取出岛叶皮层组织,并使用串联质谱标记（TMT）分析两组小鼠之间存在的差异表达蛋白。用物信息学工具分析基因的功能富集（GO）和通路富集（KEGG）情况,筛选出相关的通路,并捕捉相关重要差异蛋白,然后采用平行反应监测（PRM）验证蛋白质的差异表达。结果:1.根据SCN1A Dravet综合征小鼠基因第1外显子序列,设计了一个普通引物、WT反向引物和突变反向引物,用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。由于小鼠SCN1A基因第1外显子的抗性盒被新霉素取代,WT小鼠的预期PCR产物为357 BP,而杂合子小鼠的预期PCR产物为200 BP和357 BP。2.Scn1a+/-KO小鼠在热诱导条件下癫痫发生率高达为80%,而WT小鼠则未见任何级别及形式的癫痫发作。KO鼠中热诱导癫痫发作的的平均温度为40.0±0.4℃。脑电图显示KO鼠可见大量的高-尖棘波放电,而WT小鼠热诱导期间脑电波平稳未见癫痫波。3.对小鼠岛叶皮层区域共鉴定出260种差异表达蛋白质,其中140种被上调（53.8%）和120种被下调（46.2%）。260个差异蛋白（Scn1a基因除外）中有30个属于癫痫及癫痫相关基因及发育相关基因。GO生物学富集分子功能中前5个最显著及最相关的是蛋白转运调节、肽转运调节、心脏发育、肌肉细胞分化及细胞对热反应调节,而在在生物过程方面前5个最显著及最相关的是裂解酶活性、羧肽酶活性、羧基裂解酶活性GDP-解离抑制蛋白结合、半胱氨酸型肽酶活性。KEGG分析显示5条通路最显著的通路分别为Ras信号通路、GABAergic突触、Glutamatergic突触、Wnt信号通路、逆行内源性大麻素信号通路。PRM验证Ntrk2、Epha4、Asns、Cacna2d2、Dnajc6、Cadps2、Ank2及Atp1a1等8种癫痫及发育相关蛋白表达变化与TMT结果一致。结论:1.岛叶组织蛋白质组学分析显示Ras信号通路、GABAergic突触、Wnt信号通路、逆行内源性大麻素信号通路这4条通路和癫痫密切相关,这些信号通路的相关因子或蛋白可能在DS癫痫的发生中起到一定作用,也为DS的治疗可能提供有价值的潜在靶点。2.Glutamatergic突触信号通路在DS的发生中起到的作用可能是有限甚至是微不足道的。3.尽管SCN1A基因突变导致其他相关的癫痫和发育基因包括Ntrk2、Epha4、Asns、Cacna2d2、Dnajc6、Cadps2、Ank2及Atp1a1等为后续DS的治疗提供了进一步的研究方向。