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癫痫是一种常见的中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）疾病,以长期反复的癫痫发作为特征。反复的癫痫发作可能导致患者认知、心里以及社会活动障碍,严重影响患者的生活质量。自发性癫痫发作的病因复杂,遗传和环境因素对其有重要影响。遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+）是一种特殊类型的癫痫综合症。部分患者无法控制癫痫发作,产生相关并发症,给患者及家庭带来巨大负担。癫痫发作可能持续数年,甚至持续患者一生。目前,主要通过抗癫痫药物（antiseizure drugs,ASDs）控制癫痫发作,但ASDs对于癫痫病理生理变化以及癫痫疾病的进展作用甚微。并且将近30%的癫痫患者对ASDs产生耐药反应,无法有效控制癫痫发作。ASDs的研究是神经科学努力的方向。神经炎症指大脑内部稳态受内外环境干扰后,内部固有免疫系统的激活反应,与癫痫等多种CNS疾病密切相关。神经炎症参与癫痫发生和疾病进展,导致神经元过度兴奋并发生异常联系,导致癫痫发作。神经炎症受小胶质细胞等多种胶质细胞控制,小胶质细胞被认为是神经炎症的关键协调者,在促炎和抗炎反应中起关键作用。神经炎症可能是研究神经保护,改善认知功能障碍,以及控制癫痫发作的切入点。炎性小体作为先天免疫的感受器,在防御病原体和应对无菌炎症中都发挥重要作用,是炎症信号通路的重要部分。NLRP3（the NLR family pyrin domain containing 3）炎性小体作为熟悉的炎性复合物,参与包括癫痫在内多种CNS疾病的发生和发展,是控制癫痫发作的新靶标。胰高血糖素样肽-1（glucagon like peptide1,GLP-1）最初被认为是源于前胰高血糖素原基因细胞,具有降糖作用的肽类物质。但随后研究发现,GLP-1在CNS中也有产生,具有神经肽的功能,具备抗癫痫、抗炎及神经保护作用。实验组前期构建了背景为C57BL/6J的GABRG2基因缺陷(海马及新皮质Gabrg2fl/wtCre+,GABRG2-CKO)遗传性癫痫小鼠,在外源性热刺激下构建了GEFS+小鼠癫痫模型。索马鲁肽（Semaglutide,SEMA）作为新的GLP-1周制剂于2017年上市,我们的前期实验发现,在戊四唑（pentylenetetrazole,PTZ）点燃慢性癫痫模型中,预防性应用25 nmol/kg剂量的SEMA可减轻癫痫发作,减轻神经炎症反应,改善神经元损伤。但我们未明确SEMA抗炎及神经保护作用的潜在机制。本研究基于GABRG2-CKO遗传性癫痫小鼠GEFS+癫痫模型,应用行为学、电生理、组织学和分子生物学等方法探讨SEMA在GEFS+小鼠癫痫模型上的作用。在脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）及尼日利亚菌（Nigericin）激活的小鼠小胶质细胞系（BV2）中探讨SEMA对NLRP3炎性小体激活的作用及机制。通过激活的BV2与海马神经元细胞系（HT22）共培养,探讨SEMA在共培养HT22细胞系中发挥神经保护作用的机制。第一部分索马鲁肽在GABRG2基因缺陷小鼠GEFS+癫痫模型中对认知障碍及癫痫发作程度的影响目的明确SEMA对GABRG2基因缺陷GEFS+癫痫模型小鼠认知功能障碍及癫痫发作程度的影响。方法按照课题组先前方案,通过电加热装置给予GABRG2-CKO小鼠外源性热刺激,通过改良Racine评分,筛选出3级以上癫痫发作的GABRG2-CKO小鼠作为GEFS+癫痫模型小鼠进行后续实验。实验动物随机分为5组:（1）WT组（野生小鼠,隔天0.9%生理氯化钠注射液,0.9%Na Cl注射液;腹腔注射,intraperitoneal injection,i.p.）;（2）Control-1组（野生小鼠,隔天25 nmol/kg SEMA,i.p.）;（3）CKO组（GEFS+小鼠,隔天0.9%Na Cl注射液,i.p.）;（4）SEMA-1组（GEFS+小鼠,隔天25 nmol/kg SEMA,i.p.）;（5）VPA组（GEFS+小鼠,每天100 mg/kg丙戊酸钠,Sodium valproate,VPA,i.p.）。通过Intellicage实验、矿场实验、改良新物体识别（novel object recognition,NOR）、穿梭箱、水迷宫（Morris water maze,MWM）等行为学实验,评估SEMA对GEFS+小鼠认知功能障碍的影响。通过改良Racine评分、皮层脑电（Electrocorticography,ECo G）监测及Timm染色,评估SEMA对GEFS+小鼠癫痫发作程度的影响。结果1.在Intellicage实验中,鼻触实验显示各组间的访问次数及鼻触次数无明显差异（P＞0.05）。在位置识别中,SEMA及VPA均降低了GEFS+小鼠的错误访问次数（P＜0.05）。在反转位置实验中,SEMA和VPA均降低了GEFS+小鼠的错误访问率（P＜0.05）。在矿场实验中SEMA及VPA均降低了GEFS+小鼠边缘时间与中心时间的比值（P＜0.05）。在新物体识别实验中,SEMA和VPA均增加了GEFS+小鼠的识别指数（P＜0.05）。在主动穿梭实验中SEMA及VPA均增加了GEFS+小鼠的主动回避次数（P＜0.05）。在被动穿梭实验中SEMA及VPA均降低了GEFS+小鼠在学习阶段被电击的次数（P＜0.05）,并延长了GEFS+小鼠在测试阶段进入黑箱子的潜伏期（P＜0.05）。在MWM实验中发现SEMA及VPA均减少了GEFS+小鼠寻找逃生平台的时间（P＜0.01）增加了GEFS+小鼠穿越目标位置的次数（P＜0.05）,并增加了GEFS+小鼠在目标象限中的停留时间（P＜0.05）。2.ECoG监测显示,GEFS+小鼠癫痫发作行为和ECoG监测结果一致。SEMA及VPA均可降低GEFS+小鼠癫痫发作时ECo G的频率和幅度,减轻GEFS+小鼠的癫痫发作程度（P＜0.01）,降低GEFS+小鼠热诱导下的癫痫发作率（CKO:75%;SEMA-1:21.4%;VPA:28.6%）,降低GEFS+小鼠的死亡率（CKO:20%;SEMA-1:6.7%;VPA:6.7%）。3.Timm染色结果显示,SEMA及VPA均可减轻GEFS+小鼠海马齿状回（dentate gyrus,DG）区域的苔藓纤维发芽（P＜0.01）。结论1.SEMA改善GEFS+癫痫小鼠的认知功能障碍。2.SEMA减轻GEFS+小鼠的癫痫发作程度。3.SEMA及VPA均能减轻GEFS+小鼠的癫痫发作,减轻癫痫相关的认知功能障碍,SEMA的给药方式更利于患者长期服药。第二部分索马鲁肽在GABRG2基因缺陷小鼠GEFS+癫痫模型中对神经元损伤及NLRP3炎性小体激活的影响目的明确SEMA在GABRG2基因缺陷小鼠GEFS+癫痫模型中对神经元损伤及NLRP3炎性小体激活的作用。方法GEFS+小鼠癫痫模型构建及分组同第一部分。应用尼氏染色检测尼氏小体阳性海马神经元的数量。应用免疫荧光共染检测海马脑区,神经元特异性标志物（Neu N）及星形胶质细胞特异性标志物（GFAP）的平均荧光强度。应用免疫印迹（western-blot,WB）实验及免疫荧光染色检测NLRP3、Active caspase-3、Bax、Bcl-2以及沉默调节蛋白1（Sirtuin 1,SIRT-1）的蛋白表达和平均荧光强度。应用WB实验及免疫组织化学染色法检测炎性相关蛋白Caspase-1 p20、白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和NFκB-p65的蛋白表达及免疫组化染色阳性细胞数的百分比。结果1.SEMA和VPA均增加了GEFS+小鼠海马脑区,尼氏小体阳性神经元的数量（P＜0.05）,增强了Neu N的平均荧光强度（P＜0.05）,减弱了GFAP的平均荧光强度（P＜0.05）。免疫荧光染色法及WB实验也显示SEMA和VPA均降低了凋亡相关蛋白Active caspase-3的平均荧光强度（P＜0.01）及蛋白表达（P＜0.0001）,显著降低了Bax的平均荧光强度（P＜0.01）,增加了Bcl-2的平均荧光强度（P＜0.01）,增加了Bcl-2/Bax的比值（P＜0.001）。2.SEMA及VPA均显著降低了GEFS+小鼠海马组织NLRP3蛋白的平均荧光强度（P＜0.01）及蛋白表达（P＜0.001）,降低了Caspase-1 p20、IL-1β及TNF-α免疫组化染色中阳性细胞的百分比（P＜0.0001）和WB实验中的蛋白条带灰度值（P＜0.01）。3.SEMA和VPA均增加了GEFS+小鼠海马组织中SIRT-1蛋白的平均荧光强度（P＜0.01）和蛋白表达（P＜0.01）,降低了NFκB-p65免疫组化染色阳性细胞的百分比（P＜0.0001）和WB实验中的蛋白条带灰度值（P＜0.01）。结论1.SEMA改善GEFS+癫痫小鼠海马神经元损伤。2.SEMA抑制GEFS+癫痫小鼠海马脑区NLRP3炎性小体激活。3.SEMA的抗癫痫作用可能与抑制NLRP3炎性小体激活从而减轻神经元损伤有关。4.SIRT-1可能介导了SEMA在GEFS+癫痫小鼠中的抗炎及神经保护作用。5.SEMA和VPA均能改善GEFS+小鼠因癫痫发作引起的神经炎症及神经元损伤,SEMA的给药方式更利于患者长期服药。第三部分索马鲁肽通过SIRT-1/NLRP3/IL-1β途径发挥抗炎及神经保护作用目的研究SEMA抗炎及神经保护的作用机制,为临床研究提供理论支持。方法采用CCK8试剂盒检测SEMA在BV2细胞中的适宜浓度。将BV2细胞分为5组:（1）BV2组（0.1%二甲基亚砜,dimethyl sulfoxide,DMSO）;（2）Control-2组（900 n M SEMA）;（3）Model组（1μg/m L LPS+10μM Nigernin）;（4）SEMA-2组（900 n M SEMA+1μg/m L LPS+10μM Nigernin）;（5）EX527（SIRT-1抑制剂）组（10μM EX527+900 n M SEMA+1μg/m L LPS+10μM Nigernin）。通过Transwell小室分别将5组BV2细胞与HT22细胞进行共培养24 h。通过实时荧光定量PCR（RT-q PCR）及WB实验,检测BV2细胞中NLRP3、Caspase-1 p20以及SIRT-1的m RNA及蛋白表达含量,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞上清液中IL-1β及TNA-α的含量。采用细胞免疫荧光染色及WB实验,检测共培养HT22细胞中凋亡相关蛋白Active caspase-3的平均荧光强度及蛋白表达情况,并用流式细胞学技术检测共培养HT22细胞的凋亡情况。结果1.900 nM是SEMA在BV2细胞实验中的适宜浓度。2.SEMA减少了LPS及Nigernin诱导下BV2细胞中NLRP3蛋白及m RNA含量（P＜0.0001）,减少了Caspase-1 p20蛋白及m RNA含量（P＜0.0001）,并增加了SIRT-1蛋白及m RNA含量（P＜0.001）。SIRT-1抑制剂EX527,部分减弱了SEMA减少NLRP3蛋白及m RNA含量的作用（P＜0.05）;部分减弱了SEMA减少Caspase-1 p20蛋白及m RNA含量的作用（P＜0.01）;并部分减弱了SEMA增加SIRT-1蛋白及m RNA含量的作用（P＜0.05）。3.SEMA减少了LPS及Nigernin诱导下BV2细胞上清液中IL-1β和TNF-α的蛋白含量（P＜0.0001）。EX527部分抑制了SEMA减少BV2细胞上清液中IL-1β和TNF-α蛋白含量的作用（P＜0.01）。4.SEMA减弱了LPS及Nigernin诱导下,共培养HT22细胞中,凋亡相关蛋白Active caspase-3的平均荧光强度及蛋白表达（P＜0.0001）,EX527部分抑制了SEMA减弱Active caspase-3的荧光强度及蛋白表达的作用（P＜0.01）。5.流式细胞实验提示,SEMA改善了LPS及Nigernin诱导下,共培养HT22细胞的凋亡（P＜0.0001）。EX527部分减弱了SEMA在共培养HT22细胞中的抗凋亡作用（P＜0.0001）。结论1.SEMA抑制激活BV2细胞中NLRP3炎性小体激活,并抑制下游炎性因子释放。2.SEMA在激活BV2细胞和HT22细胞共培养下,对共培养HT22细胞具有神经保护作用。3.SEMA的抗炎及神经保护作用部分依赖于SIRT-1/NLRP3/IL-1β途径调节。