金黄色葡萄球菌(简称金葡菌,Staphylococcus aureus,S.aureus)是一种重要的人兽共患病病原菌,金萄菌耐药性越来越严重,日益成为全球关注的公共卫生问题。作为金萄菌感染的主要毒力因子,α-溶血素(Hlα,α-hla)是目前金萄菌毒力因子中研究最多、也是致病力最强的一种,可引起多种宿主细胞损伤。此外,α-溶血素可以通过金萄菌分泌的膜泡(SMVs)转运,这也是α-溶血素得以扩散的原因。在本研究中,为了考查金萄菌α-溶血素的致病机制,我们将先对携带α-溶血素的金葡菌SMVs分泌与α-溶血素表达之间的相关性进行探究,这将为我们后续的抗金萄菌α-溶血素引起相关炎症的药物发现奠定基础。巨噬细胞(Macrophages)是重要的免疫效应细胞,作为机体对抗金萄菌病原体的第一道防线,当金萄菌入侵机体时,巨噬细胞迅速发生反应抵抗菌体入侵。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)能够参与多种生物过程,包括细胞增殖、分裂等,还对巨噬细胞的炎症和免疫反应具有调节作用。有的报道表明,金萄菌可通过依赖NLRP3的细胞坏死程序诱导细胞死亡,从而导致内源性促炎性分子的释放,但是具体机制不清。细胞内NF-κB活化和相关因子激活是调控炎症反应的一个重要机制。综上,MAPKs、NF-κB、NLRP3通路与炎症的发生具有重要相关性。因此,本研究也将探索MAPKs、NF-κB和NLRP3在金萄菌α-溶血素诱导炎症中的作用机制。联合治疗是治疗复杂性细菌感染的有效策略。在本研究中,我们还将针对顽固的金萄菌及其α-溶血素诱导的炎症,探索通过联合治疗方法给出解决方案。在众多抗微生物药物当中,氯唑西林(Clozacillin,CXN)是一种β-内酰胺类药物,对耐药金萄菌有很强的杀菌作用,被称为“抗葡萄球菌青霉素”,常用于治疗动物的葡萄球菌感染。四环素(Tetracycline,TC)是一种广谱抑菌剂,有报道表明四环素也是一种自溶(Autolysis)抑制剂,细菌自溶作用是菌体细胞的自我毁灭行为,溶酶体释放出来酶将自身细胞降解,四环素能显著降低细菌的自溶现象发生,其对金萄菌的自溶抑制能力更值得挖掘。外排泵是细菌耐药性产生的重要机制之一,硫利达嗪(Thioridazine,TZ)是临床用于治疗焦虑症药物,最近研究表明硫利达嗪同时也是一种外排泵抑制剂,已用于治疗结核分枝杆菌感染的临床实验,所以考查硫利达嗪是否可以作为抗金萄菌外排泵抑制剂具有重要意义。这样,我们以抗葡萄球菌专用药氯唑西林、自溶抑制剂四环素和外排泵抑制剂硫利达嗪三个药物为成分,组成抗金萄菌α-溶血素引起炎症的“三药组合”,考查该三药组合是否能抑制金萄菌、抑制金萄菌α-溶血素的表达及溶血活性、抑制由金萄菌α-溶血素诱导的体内外炎症反应;同时还要明确金萄菌α-溶血素引起的炎症是否由MAPKs/NF-κB/NLRP3通路介导,并且探究我们设计的三药组合是否抑制了该机制介导的炎症。首先,我们考查了三药组合抗金萄菌活性,以及三药组合对α-溶血素表达、α-溶血素的溶血活性和对携带α-溶血素的SMVs分泌的抑制作用。一方面,为确定三药组合体外试验作用浓度,我们采用抗菌药物敏感试验和棋盘稀释法进行联合药敏试验,结果表明三药组合在抗金萄菌活性上显示出协同作用;我们选择三药组合有协同效果时亚抑制浓度为氯唑西林(0.015625μg/m L)、硫利达嗪(0.25μg/m L)和四环素(0.03125μg/m L)作为后续所有的体外实验最适浓度,此时氯唑西林、硫利达嗪、四环素的质量/体积浓度比(或质量比)为1:16:2。另一方面,我们借助Western blot检测表明三药组合显著抑制金萄菌α-溶血素表达;利用血平板溶血实验和酶标仪分析显示,最适浓度三药组合可显著抑制金萄菌α-溶血素的溶血活性;通过扫描电镜观察到三药组合显著抑制金葡菌分泌携带α-溶血素的SMVs。这些结果共同表明,最适浓度三药组合通过抑制金葡菌分泌携带α-溶血素的SMVs,减少α-溶血素表达,从而抑制α-溶血素的溶血活性。其次,我们进一步考查三药组合对金萄菌α-溶血素激活巨噬细胞相关炎性因子的抑制能力和可能的作用机制。我们采用Western blot技术对金萄菌8325-4菌株(α-溶血素基因hlα正常株)、金萄菌DU1090菌株(α-溶血素基因hlα缺失突变体)作用的巨噬细胞中炎性蛋白MAPKs(p-ERK、p-p38、p-JNK)、NF-κB(IKK、IκB、NF-κB)以及NLRP3炎性小体(ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、NLRP3)的表达情况进行了分析,利用各通路抑制剂处理来进一步探究MAPKs通路、NF-κB通路和NLRP3炎性小体之间的上下游关系。结果显示,金萄菌8325-4处理组较DU1090处理组和空白组巨噬细胞MAPKs、NF-κB、NLRP3通路相关通路蛋白表现出不同程度的表达量增加,而最适浓度三药组合处理可显著下调MAPKs通路(p-ERK、p-JNK和p-p38)、NF-κB通路(NF-κB、IKK)、NLRP3炎性小体通路(ASC、Caspase-1、IL-18和IL-1β)蛋白的表达;另外,MAPKs通路特异性抑制剂SP600125(JNK抑制剂)、PD98059(ERK抑制剂)和SB203580(P38抑制剂)可显著抑制NF-κB通路蛋白和NLRP3炎性小体蛋白的表达,表明MAPKs位于NF-κB、NLRP3上游;BAY11-7082(NF-κB抑制剂)能够显著阻断NLRP3炎性小体蛋白的表达,但不能抑制MAPKs通路蛋白的磷酸化,表明NF-κB位于NLRP3上游;而Ac-YVAD-cmk(Caspase-1抑制剂)对其它通路均不存在抑制作用。综上结果表明,最适浓度三药组合通过抑制α-溶血素诱导MAPKs/NF-κB/NLRP3炎症通路激活发挥抗炎作用,且MAPKs位于NF-κB和NLRP3的上游;而NF-κB位于NLRP3炎性小体的上游。最后,我们建立小鼠腹膜炎模型,在体内考查三药组合【氯唑西林(1.6125mg/kg)+硫利达嗪(25 mg/kg)+四环素(3.125 mg/kg)】对金萄菌感染引起小鼠腹膜炎的保护情况。结果表明,金萄菌DU1090引起的炎症病理变化较8325-4菌株弱,三药组合可显著减少小鼠腹膜炎模型组中金萄菌感染的菌落数,也降低炎症病理变化和炎性细胞因子水平(如IL-1β和TNF-α),并抑制腹膜巨噬细胞中MAPKs/NF-κB/NLRP3通路相关蛋白的表达。综上研究结果表明,三药组合对金萄菌感染引起的小鼠腹膜炎具有保护作用。总之,本研究阐明三药组合(氯唑西林、硫利达嗪、四环素)具有良好抗葡萄球菌活性,能显著抑制金萄菌α-溶血素的表达及其溶血活性,及抑制金萄菌分泌携带α-溶血素的SMVs,并能通过抑制MAPKs/NF-κB/NLRP3通路减轻金萄菌α-溶血素引起的炎症反应,是一种新型抗金萄菌感染的药物组方,这为金萄菌感染的有效治疗打下了坚实的理论和物质基础。