研究背景克罗恩病是一种以透壁性炎症反应为主,伴有肌层过度生长、胶原纤维化为特点的慢性进展性胃肠道疾病,并最终招致以腹痛、腹泻、恶心、呕吐等为特点的临床症状。超过1/3的克罗恩病患者发生小肠纤维化及肠梗阻,大部分肠狭窄患者至少需接受一次手术以缓解症状。克罗恩病病因复杂,多认为其致病因素与饮食、环境、免疫、遗传、感染等多种因素相关,但是具体机制仍不了解。小肠纤维化是炎症性肠病的常见并发症。而最近的研究表明小肠纤维化过程是通过常见的纤维化过程进行的,具有慢性进展性的特点,牵涉到细胞外基质蛋白过度沉积,比如胶原蛋白(collagens)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA,α-smooth muscle actin)、成纤维特异蛋白 1(FSP1，fibroblast-specific protein 1),而肌成纤维细胞是细胞外基质的一个主要来源。间充质细胞包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞,应该为小肠纤维化负主要责任,它们能导致肠道重构和纤维化,而间充质细胞的来源是哪里呢?有研究表明小肠上皮细胞在炎症、损伤等刺激下可通过EMT转变为间质细胞,是间充质细胞的重要来源。上皮间充质转化(EMT)是涉及细胞内外多种转导通路的复杂过程,它能激活包括心脏、肺、肝脏、肾脏以及肠道在内的多种组织器官的肌成纤维细胞,最后导致纤维化。另外,大鼠小肠上皮细胞的EMT过程也包括EMT另外一个基本特征——基底极性蛋白(细胞角蛋白)、细胞连接蛋白(E-钙黏蛋白)——的降低,其最终能增加细胞的迁移及侵袭能力并促进细胞增殖,最终结果都是导致器官组织各层结构发生纤维化。甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)首先是在恶性肿瘤伴发高钙血症的患者中发现,因其功能和基因结构都类似于甲状旁腺激素(PTH)而被命名为PTHrP,被发现广泛表达于大部分的胚胎和人体组织。有证据表明PTHrP和PTH/PTHrP受体的基因和蛋白在肠绒毛上皮细胞也有所表达。在小鼠肾脏梗阻模型中证实PTHrP 能和 TGF-β1、内皮生长因子(endothelial growth factor,EGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等一起在肾纤维化过程中相互作用,而在叶酸导致的急性肾损伤模型中,PTHrP能促进肾小管间质的凋亡和纤维化,除此之外也有促进胰腺纤维化、肝脏纤维化的作用。PTH在临床上已经被用作治疗骨质疏松的药物,其临床效果可观。最初发现的PTHrP主要与钙磷的调节相关,因其是一个起效快、副作用少的骨形成剂,现拟将其作为一个良好的促骨形成药应用于临床,并且PTHrP也已经进入了临床试验阶段第三期,但是在其治疗期间是否能引起其他器官组织的纤维化需要引起我们的重视。现PTHrP作为一个多功能蛋白,不但在不同的组织中有不同的作用,而且可能在同一组织中也有不同的作用,由此引发我们的深度思考:PTHrP对骨质疏松的患者是利大于弊还是弊大于利?我们该如何评估其作用?我们需要注意一些什么副作用?PTHrP在许多组织器官中均能促进EMT的发生,在肾纤维化过程中同样有此作用,鉴于PTHrP的多器官促纤维化作用,而且已有报导证实PTHrP能诱导大鼠小肠上皮细胞IEC-6的凋亡。我们有理由相信PTHrP可能是小肠纤维化的一个调节物,而且可能是通过EMT这一过程的,但是PTHrP在肠纤维化中的具体作用还没有被证实。在绝大多数情况下PTH和PTHrP是通过PTH1R(PTH receptor 1)而发挥各种作用的。早期的研究证实在肝脏和肾脏等组织器官中PTHrP除能和PTH1R结合而发生促纤维化作用,还能促进TGF-β 1的分泌进而促进纤维化。PTHrP导致细胞表型变化所涉及的细胞信号通路也已经得到广泛的探讨。经典的通路是通过G蛋白耦联受体激活蛋白激酶A和C(protein kinases A and C,PKA and PKC),同时在纤维化过程中研究较为清楚的还包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated kinases,MAPKs)信号通路、TGF-β1-smad 信号通路和Wnt信号通路。MAPK信号通路包括细胞外信号调节激酶(extracellular-signal-regulated kinases,ERKsl/2)、p38 和 c-jun 氨基末端激酶(N-terminal c-Jun kinase,JNK)。肠纤维化因其病理过程复杂,可能涉及多条信号通路参与,进而调节细胞外基质(ECM)沉积的过程,最终导致肠纤维化。研究目的和意义由于炎症性肠病的严重并发症和治疗效果的不理想,加之发病率在我国的升高,肠纤维化已经成为研究热点。PTHrP在抗骨质疏松方面的应用前景,促使我们考虑PTHrP对小肠上皮细胞的影响作用,并且可能使我们找到了另外一条治疗途径,同时在本实验中初步探讨了 TGF-β1和PTHrP的作用,为PTHrP在肠纤维化中的作用提供了更可靠的理论依据。材料和方法1、实验所需要的大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)来自本实验收藏。分别予不同的PTHrP 片段(1-40,67-86,和 134-173)及不同浓度的 PTHrP(1-40)(0.1nM、1nM、10nM、100nM)或 PTHrP(1-40)(10nM)刺激不同的时间(6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h),在应用不同的通路抑制剂时,包括PTHrP抑制剂PTHrP(7-34)、TGF-β1I型受体抑制剂SD208(10μM)、TGF-β1Ⅰ/Ⅱ型受体抑制剂LY2157299(10μM)、PKA 抑制剂 H-89(10uM)、PKC 抑制剂 Go6983(10uM)、PKC激活剂PMA(1uM),抑制剂需预先孵育2小时,后收集细胞总蛋白或总RNA进行下一步实验;2、运用相对定量逆转录-聚合酶链式反应技术(comparative quantitative real-time RT-PCR,RT-qPCR)在基因水平检测处理后的相关目的蛋白(E-cadherin、collagen I、TGF-β 1 和 FSP1)。蛋白质印迹方法(Western-blot)在蛋白水平检测上述处理后细胞产物的活化相关因子(E-cadherin、collagen I、TGF-β1、FSP1、P-PKC α/β/PKC α/β、PKA C-α);3、通过运用细胞免疫荧光方法(Immunofluorescence)检测PTHrP(10 nM)处理IEC-6 48h后各种相关蛋白的表达情况,PTHrP抑制剂PTHrP(7-34)、TGF-β 1受体抑制剂 LY2157299(10uM)和 SD208(10uM)、PKA 抑制剂 H-89(10uM)、PKC 抑制剂 Go6983(10uM)、PKC 激活剂 PMA(1uM)后 PTHrP(10nM)对 IEC-6细胞各种目的蛋白表达的影响;4、应用CCK-8在不同浓度或不同时间条件下IEC-6细胞的增殖效率,或用EdU细胞增殖方法检测细胞的增殖率;5、用Tanswellassay方法检测PTHrP(1-40)是否能促进细胞的迁移和侵袭;6、统计学分析:本实验所有结果均用均数±标准差表示,所有数据都采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,多个样本均数的比较采用多样本均数比较方差分析(Oneway-ANOVA),方差齐时采用Dunnett和LSD方法,当方差不齐时可采用DunnettT3检验方法。其中RT-qPCR的结果及Western-blot的结果其对照组统一量化为1,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、我们通过应用RT-qPCR和Western-blot的方法发现PTHrP主要是通过1-40而不是67-86或134-173诱导IEC-6产生EMT,我们发现IEC-6在PTHrP(1-40)浓度为10nM处理48h的情况下Collagen I呈现3.4倍的上调趋势(P<0.01);10nM处理条件下E-cadherin下降为对照组的1/3(P<0.01);10nM处理条件下FSP1上调2.4倍(P<0.01)。在用TGF-β 1 4ng/ml作为阳性对照的情况下,为进一步验证PTHrP的诱导作用,预先孵育PTHrP拮抗剂PTHrP(7-34)1uM2h,再用 PTHrP 刺激 48h,然后观察上述指标,E-cadherin、collagen I、TGF-β1和FSP1与对照组无统计学差异,反之与阳性对照组及PTHrP组有统计学差异。2、IEC-6经PTHrP(1-40)处理后出现TGF-β1的蛋白和基因水平均明显升高,在PTHrP(7-34)存在的情况下TGF-β 1的升高被抑制。随之我们在处理前2h予TGF-β受体抑制剂:TGF-β 1 I型受体抑制剂SD208(10uM)或者TGF-β1 Ⅰ/Ⅱ 型受体抑制剂 LY2157299(10 μM),发现应用 SD208+PTHrP(1-40)或LY2157299+PTHrP(1-40)的组其 E-cadherin、collagen I 和 FSP1 蛋白变化均较对照组无明显差异。3、在PTHrP(1-40)浓度为0.1-100nM的条件下对IEC-6发生EMT改变呈剂量-效应关系,在浓度为10-100nM的情况下E-cadherin、collagen I、TGF-β1和FSP1的蛋白和基因均出现明显的变化。在PTHrP 1-40(10nM)处理IEC-6细胞0-72h的条件下,collagen I、TGF-β 1和FSP1的蛋白和基因呈先上升后下降,而E-cadherin的蛋白和基因为先降后升的变化。4、用PTHrP(1-40)处理IEC-6细胞后检测PKA、PKC等的变化,发现以上信号通路在相同的时间点均能被激活,PKC和PKA通路均在7min开始激活。在给予PKA 抑制剂 H-89(10uM)、PKC 抑制剂 Go6983(10uM)、PKC 激活剂phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)(1uM)后再予 PTHrP 1-40(10 nM)的条件下,发现在给予抑制剂H-89能有效抑制TGF-β1的升高,PKC抑制剂Go6983不能产生类似于H-89的作用,同样PMA也不能引起TGF-β 1的升高。Go6983 和 H-89 均能抑制 PTHrP(1-40)引起的 E-cadherin、collagen I、FSP1的蛋白水平变化,相反PKC激活剂PMA在IEC-6细胞中能产生类似于PTHrP的效应。5、应用细胞免疫荧光技术检测各种处理条件下的蛋白水平变化与western-blot结果相符。6、PTHrP(1-40)在浓度为10nM和100nM的时候能促进细胞的增殖,在浓度为10nM的时候24小时即能促进细胞的增殖。7、当PTHrP(1-40)浓度为10nM的时候能促进IEC-6细胞的迁移和侵袭。主要结论1、PTHrP是通过片段1-40而不是67-86或134-173来促进大鼠小肠上皮细胞发生EMT现象。给予PTHrP抑制剂PTHrP(7-34)后其相关蛋白的改变可被抑制。2、PTHrP(1-40)能促进TGF-β1的合成分泌。IEC-6细胞经PTHrP(1-40)刺激后可出现TGF-β 1合成和分泌的升高,在10nM处理36h后可有明显差异,应用PTHrP(7-34)可以抑制TGF-β1蛋白水平的变化。3、TGF-β 1受体抑制剂可以抑制EMT的发生。TGF-β 1 I型受体抑制剂SD208和TGF-β1 Ⅰ、Ⅱ型受体抑制剂LY2157299可部分阻断PTHrP(1-40)引起的E-cadherin、collagen I 和 FSP1 的蛋白变化。4、PTHrP(1-40)促进IEC-6细胞发生EMT和TGF-β 1的合成分泌呈时间浓度效应。PTHrP(1-40)在 10nM 下即可引起 E-cadherin、collagen I、TGF-β1和FSP1的蛋白和基因水平的变化,而且有时间效应关系,在48h内可以起E-cadherin、collagen I、TGF-β1和FSP1的蛋白和基因水平的变化。5、PTHrP 1-40通过PKA通路影响TGF-β1的分泌,但是PKA和PKC通路都可以影响EMT。PTHrP 1-40(10nM)处理IEC-6细胞后PKA和PKC等通路可被激活。PTHrP(1-40)可能是通过PKA通路引起TGF-β 1是增高,而PKA抑制剂H-89、PKC抑制剂Go6983能完全阻断PTHrP(1-40)引起的EMT相关蛋白的变化。PKC激活剂PMA能产生类似于PTHrP(1-40)的作用。6、PTHrP(1-40)能促进IEC-6细胞的增殖、迁移和侵袭。