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小鼠乳腺的发育是一个依赖于乳腺干细胞自我更新和分化的缓慢且复杂的过程。PD-L1广泛表达于多种人类肿瘤中,阻断PD-L1/PD-1通路已经用于多种癌症的治疗方案中。在正常生理条件下,PD-L1 m RNA在人和小鼠的多种组织和器官中表达比较丰富,但PD-L1蛋白水平的表达非常低,并且到目前为止人们对PD-L1在正常组织器官发育过程中的主要生理功能所知甚少。在本研究中,我们对PD-L1在小鼠乳腺组织中的表达和PD-L1在小鼠乳腺发育中的功能进行了系列研究。首先,我们对PD-L1在小鼠乳腺细胞中的表达以及PD-L1标记的乳腺细胞亚群的特性进行了研究。在小鼠的乳腺组织中,通过流式分析我们发现PD-L1表达于乳腺上皮细胞中;通过测序同时验证了PD-L1于Procr+乳腺干细胞（mammary gland stem cells,Ma SCs）中富集。通过体外3D克隆形成实验我们发现PD-L1+基底上皮（basal）细胞表现出更好的克隆形成能力;在对PD-L1+基底上皮细胞的乳腺移植实验中我们确定了PD-L1+基底上皮细胞呈现较高的乳腺再生能力。这些实验数据表明PD-L1+基底上皮细胞具备乳腺干细胞的性质。为验证PD-L1在乳腺再生中的必要性,我们进行了在基底上皮细胞中对PD-L1进行敲低后的体外克隆形成实验和体内乳腺移植实验,实验结果表明在对PD-L1进行敲低后会降低基底上皮细胞的克隆形成能力和降低乳腺再生的效率,甚至会在一定程度上推迟妊娠期乳腺组织中腺泡（alveolar）结构的形成;PD-L1的过量表达能够增强乳腺基底上皮细胞的克隆形成和乳腺重建能力。其次,我们对PD-L1在小鼠整个乳腺发育中发挥的作用进行了研究。为了更好地理解PD-L1+基底上皮细胞在生理条件下的特定表达模式和作用特点,我们构建了一种PD-L1Cre ERT2-2A-td Tomato-WERP-p A基因敲入突变型小鼠,并以该基因型报告小鼠为研究对象展开实验研究。通过对乳腺导管的组织切片进行免疫荧光成像实验,结果显示td Tomato+（PD-L1+）细胞的确表达于基底细胞层;通过不同发育阶段乳腺导管的whole mount 3D共聚焦成像分析,分析结果具体展示了td Tomato+（PD-L1+）细胞的在乳腺导管组织的空间表达;接着通过对基因型鼠不同发育阶段的乳腺组织进行流式分析实验,我们发现杂合子小鼠乳腺发育过程中td Tomato+（PD-L1+）细胞在乳腺上皮细胞中的分布也不是恒定不变的,并且PD-L1表达于乳腺上皮细胞的基底上皮细胞中,而在管腔上皮细胞中不表达。以上结果与我们之前研究的野生型小鼠乳腺PD-L1+细胞表达模式一致。此外,我们还对PD-L1Cre ERT2-2A-td Tomato-WERP-p A纯合小鼠在不同发育阶段的乳腺组织形态进行了考察,结果表明,在PD-L1缺失后小鼠青春期乳腺的发育明显受到了延迟,并且小鼠妊娠早期的腺泡（alveolar）结构的形成呈现显著的滞后。在对PD-L1Cre ERT2-2A-td Tomato-WERP-p A纯合小鼠乳腺基底上皮细胞进行体外3D培养和体内乳腺移植实验我们发现,在缺失了PD-L1后的小鼠乳腺基底上皮细胞克隆形成能力不受影响但是乳腺移植再生的效率显著降低。以上这些实验结果都说明我们构建的PD-L1Cre ERT2-2A-td Tomato-WERP-p A基因型小鼠在乳腺发育的整个过程中的td Tomato荧光表达确切地再现了内源性PD-L1的表达情况,并且进一步验证了PD-L1在小鼠乳腺发育与乳腺再生中发挥着非常重要的作用。再次,我们对PD-L1标记的乳腺细胞的命运进行了研究。我们运用谱系追踪策略,对PD-L1+细胞在PD-L1Cre ERT2/+;R26m Tm G/+基因型小鼠乳腺不同发育阶段的命运进行了追踪实验。有趣的是,在通过对胚胎期E18.5,青春期前,青春期,成年期,妊娠期小鼠分别进行追踪并在追踪后不同时间点进行分析实验,我们发现经过短期追踪,标记的GFP+（PD-L1+）细胞最初是乳腺基底上皮细胞;在经过长期的追踪实验我们发现,PD-L1+细胞具备分化为乳腺基底上皮细胞和管腔上皮细胞的能力;此外,通过对青春期小鼠进行多次妊娠期的长期追踪实验,我们确定GFP+（PD-L1+）细胞能够长期维持乳腺干细胞的自我更新的干性特征。综上所述,通过对GFP+（PD-L1+）细胞的谱系追踪的结果进行分析,表明PD-L1+细胞可以分化为所有的乳腺上皮细胞谱系。最后,我们对PD-L1在乳腺发育中潜在的调控机制进行了探索。通过双分子荧光素酶活性检测实验,MMTV-Wnt1小鼠不同发育阶段的中PD-L1表达的流式分析和添加了wnt3a配体和CHIR小分子的3D Matrigel培养实验,我们发现在对Wnt进行持续性激活的状态下,PD-L1的表达水平显著上调。这些结果表明PD-L1的表达受Wnt/β-catenin信号通路的持续激活诱导。综上所述,我们的研究表明PD-L1富集于小鼠乳腺干细胞中,是乳腺再生所必需,并且标记一群多能乳腺干细胞。这为PD-L1在组织发育中的生理功能的研究提供了新的视角。