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研究背景乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤,近年来随着诊疗手段的不断进步与发展,乳腺癌的病死率逐年下降,但是治疗中出现的治疗抵抗、复发及转移仍是我们面临的巨大挑战,尤其是在缺乏治疗靶点的三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)中。EGFR是表皮生长因子,它与其下游的多条信号通路在乳腺癌的发生发展及治疗抵抗中有重要作用。程序性死亡配体1(Programmed deadth ligand-1,PD-L1)是一种重要的免疫抑制蛋白,表达于黑色素瘤、肺癌及乳腺癌等多种癌细胞表面,可通过与活化的T淋巴细胞表面表达的PD-1相互作用介导癌细胞的免疫逃逸。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)中,EGFR与PD-L1的表达呈正相关,在食管鳞癌中,EGFR也可通过下游EGFR-PI3K-AKT、EGFR-Ras-Raf-Er K及EGR-PLC-γ等多条信号通路调控癌细胞表面PD-L1的表达。但是EGFR与PD-L1的表达在乳腺癌中是否也有类似的相关性,并且EGFR及PD-L1在乳腺癌细胞的干性调控中是否也有相互作用尚不明确。研究目的本课题将主要探索EGFR及PD-L1在乳腺癌细胞系增殖、迁移、干性调控等方面的作用,探究EGFR-TKIs及PD-1/PD-L1抑制剂在乳腺癌细胞系中的抗肿瘤疗效,并探讨乳腺癌组织中EGFR及PD-L1的表达与患者临床病理特征之间的关系。研究方法1.用Western Blot技术检测不同乳腺癌细胞系中内源性EGFR及PD-L1的表达情况。2.用Western Blot技术检测乳腺癌贴壁细胞及乳腺癌干细胞微球中EGFR及PD-L1的表达情况。3.用细胞毒性实验(MTT法)明确EGFR-TKIs(AG-1478)及PD-1/PD-L1抑制剂(BMS-202)在不同乳腺癌细胞系中的半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)。4.通过二维克隆形成及划痕实验,研究AG-1478及BMS-202单药及双药联合对不同乳腺癌细胞系增殖及迁移能力的影响。5.用Western Blot技术检测并比较乳腺癌组织及配对癌旁组织中EGFR及PDL1的表达情况。6.用免疫组织化学方法研究EGFR及PD-L1在乳腺癌及癌旁组织中的表达定位。7.用SPSS24.0软件分别分析乳腺癌组织中EGFR及PD-L1的表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系。8.用Gentle MACS Dissociator自动组织温和处理器提取原代乳腺癌细胞,并进行原代乳腺癌贴壁细胞及干细胞微球的培养,为在原代乳腺癌细胞中进一步研究EGFR及PD-L1的表达调控奠定基础。结果:1.三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、HCC-1806中EGFR及PD-L1均呈高表达;HER2(+)乳腺癌细胞系SKBR3中EGFR高表达,PD-L1低表达;非三阴性乳腺癌细胞系MCF-7中EGFR及PD-L1均为低表达;BT474中EGFR及PD-L1均不表达。2.与相同的乳腺癌细胞系贴壁细胞相比,MDA-MB-231、HCC-1806及MCF-7乳腺癌干细胞微球中EGFR及PD-L1的表达均明显上调。3.EGFR-TKIs(AG-1478)及PD-1/PD-L1抑制剂(BMS-202)对乳腺癌细胞系MDA-MB-231、HCC-1806及MCF-7增殖、迁移的细胞生物学功能均有不同程度的抑制作用,在三阴性乳腺癌细胞系中更加明显,但双药联合抗肿瘤疗效并不优于单药。4.Western blot结果显示与乳腺癌组织相比,配对的癌旁组织中EGFR及PD-L1的表达均明显上调。5.免疫组化结果显示EGFR与PD-L1在乳腺癌组织中均主要以细胞浆膜表达为主,细胞核表达少;乳腺癌组织中EGFR的表达与PR表达状态有关(P=0.037),PD-L1的表达与组织学分级有关(P=0.011),且EGFR及PD-L1在TNBC中平均表达水平要高于其他分子分型的乳腺癌。6.已可用Gentle MACS Dissociator自动组织温和处理器成功提取到原代乳腺癌细胞,并且已初步建立原代乳腺癌贴壁细胞及干细胞微球的培养方法。结论:1.三阴性乳腺癌细胞系中EGFR与PD-L1的表达水平呈正相关,且EGFR及PD-L1对乳腺癌细胞干性的维持有重要作用。2.TNBC细胞系中,EGFR-TKIs及PD-1/PD-L1免疫抑制剂联合应用的抗肿瘤疗效并不优于单药,但其临床疗效有待动物实验及临床试验进一步研究证实。3.EGFR及PD-L1在乳腺癌组织中均主要以细胞浆膜表达为主,在癌旁组织中均主要以细胞浆表达为主,因此表达于细胞膜上的EGFR及PD-L1是三阴性乳腺癌临床治疗中的主要靶点。4.乳腺癌组织中EGFR及PD-L1均以细胞浆膜表达为主,EGFR的表达与PR表达状态相关,PR缺失的乳腺癌患者EGFR高表达率更高,PD-L1的表达与组织学分级相关,组织学分级越高,PD-L1高表达率越高,说明EGFR及PDL1与乳腺癌患者的不良预后密切相关。