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本课题在莪术、三棱单味药体内体外抗肝癌药效学研究基础上,进一步探究其复方配伍对荷瘤小鼠生命体征、血清细胞因子、炎性因子及Rel细胞蛋白家族的影响,并结合体外实验探究其对NF-κB信号通路中结合蛋白的调控和干预,从而阐明二者复方配伍通过NF-κB信号通路调控肝癌细胞干预增殖和诱导凋亡的作用机制。一、莪术、三棱单味药体内、体外的抗肝癌药效学研究1.体内构建H22肝癌细胞皮下移植瘤小鼠模型并进行模型评价。结果显示,各组小鼠皮下移植瘤组织生长均匀,体积均>100mm~3,瘤重均>400mg,HE病理染色观察可见小鼠皮下移植瘤细胞核呈深蓝色,核浆比高。造模成功率为100%,小鼠存活率为98%,提示此种造模方法可行。2.探究莪术、三棱单味药体内抗肝癌的作用。分别以莪术、三棱单味药及阳性对照药对H22肝癌细胞皮下移植瘤小鼠进行干预,结果如下。各组小鼠体重结果:与空白对照组小鼠相比,各组荷瘤小鼠体重减少量均>10%;各组小鼠移植瘤体积结果:与模型组相比,莪术高剂量组小鼠皮下移植瘤体积明显减小（P<0.01）,莪术中剂量组、三棱高剂量组小鼠皮下移植瘤体积减小（P<0.05）;各组小鼠胸腺结果:与模型组相比,阳性药组胸腺重量较小（P<0.05）,胸腺指数低（P<0.05）,与阳性药组相比,中药各给药组胸腺重量大（P<0.05）,胸腺指数高（P<0.05）;各组小鼠移植瘤抑制率结果:与模型组相比,莪术高、中剂量组、三棱高剂量组平均瘤重明显小于模型组（P<0.01）,抑瘤率分别为56.71%、44.63%、42.62%。阳性药组平均瘤重最小,抑瘤率最高为89.93%。三棱低剂量组平均瘤重最大,抑瘤率最低为7.38%。提示莪术、三棱单味药体内具有抗肝癌作用。3.探究莪术、三棱单味药有效成分体外抗肝癌的作用。采用MTT法探究莪术、三棱的有效活性成分---莪术醇、三棱内酯B对Hep G2肝癌细胞增殖的影响。结果表明莪术醇、三棱内酯B对Hep G2细胞增殖均有明显抑制作用,IC50分别为216.53μg/ml、301.48μg/ml。表明莪术、三棱单味药有效成分莪术醇、三棱内酯B可通过抑制肝癌细胞的增殖而发挥抗肿瘤作用。二、莪术、三棱复方配伍的抗肝癌的药效学研究1.探究莪术、三棱配伍复方对H22荷瘤小鼠体内抗肝癌作用。分别以莪术、三棱复方配伍及阳性对照药对建模后荷瘤小鼠进行干预,结果如下。各组小鼠体重结果:与模型组相比,复方给药各组体重与模型组无明显差异;与阳性药组相比,复方给药各组在第12天以后体重明显高于阳性药组（P<0.01）,其中复方高剂量组在第9天已呈现增高趋势（P<0.05）。各组小鼠移植瘤体积结果:与模型组相比,复方高剂量组在第9天以后,移植瘤体积明显减小（P<0.01）;复方中剂量组在第12天以后,移植瘤体积明显减小（P<0.01）;复方低剂量组在第15天后移植瘤体积减小（P<0.05）。观察胸腺相关结果:与模型组相比,阳性药组胸腺重量较小（P<0.05）,胸腺指数低（P<0.05）;与阳性药组相比,复方各给药组胸腺重量大（P<0.05）,胸腺指数高（P<0.05）。各组小鼠移植瘤抑制率结果:与模型组相比,复方高、中剂量组平均瘤重明显低于模型组（P<0.01）,抑瘤率分别为64.26%、40.33%。阳性药组平均瘤重最低,抑瘤率最大为89.51%。提示莪术、三棱配伍复方对H22荷瘤小鼠体内抗肝癌作用。2.探究莪术、三棱单味药有效成分的联合应用对体外肝癌细胞的抑制增殖作用。各组药物对该细胞增殖均有明显抑制作用,其中联合1000.00μg/ml剂量组的细胞增殖抑制率为76.47%,联合500.00μg/ml剂量组的细胞增殖抑制率为74.51%,联合250.00μg/ml剂量组的细胞增殖抑制率为67.65%,联合125.00μg/ml剂量组的细胞增殖抑制率为60.78%,联合62.50μg/ml剂量组的细胞增殖抑制率为42.16%。提示莪术醇联合三棱内酯B于体外研究具有抗肝癌细胞增殖的作用,且随着给药浓度增加,抑制率呈增强趋势。3.探究莪术、三棱复方配伍对NF-κB通路中相关炎症因子的影响。采用ELISA法测各组TNF-α、IL-1α、IL-6水平。结果表明,莪术三棱复方配伍可显著降低TNF-α、IL-6含量（P<0.01）,对IL-1α的含量影响不显著。三、莪术、三棱配伍对NF-κB通路中相关蛋白表达的作用机制研究1.探究莪术、三棱复方配伍体内抗肝癌作用机制的研究。采用免疫组化法测各组NF-κBp65、BCL-2、BAX水平。结果表明:莪术、三棱复方配伍可降低NF-κBp65、BCL-2含量,增加BAX含量。提示莪术、三棱复方抗肝癌作用机制可能与减少TNF-α、IL-6、NF-κBp65、BCL-2,增加BAX有关,推测莪术、三棱复方抗肿瘤作用机制与调控NF-κB信号通路相关。2.探究莪术、三棱有效组分配伍体外抗肝癌作用机制的研究。通过western Blot法检测IKK-α/β、IκB-α两种蛋白在莪术醇联合三棱内酯B干预人肝癌Hep G2细胞后而阐明莪术醇联合三棱内酯B对Hep G2细胞的拮抗作用机制。western Blot法测得IKK-α/β蛋白空白对照组、联合500.00μg/ml组、联合250.00μg/ml组、联合125.00μg/ml组灰度值以次为:1.47±0.10、0.49±0.02、0.74±0.06、0.85±0.07;IκB-α蛋白灰度值依次为:0.53±0.04、0.98±0.09、0.62±0.07、0.47±0.02。结果表明,与空白对照组相比,各联合给药组IKK-α/β蛋白表达降低,提示莪术醇联合三棱内酯B可抑制IKK-α/β蛋白在Hep G2细胞中的表达;与空白对照组相比,各联合给药组IκB-α蛋白表达升高,提示莪术醇联合三棱内酯B可促进IκB-α蛋白在Hep G2细胞中的表达,且随着给药浓度的增加,促进作用增强。