论文部分内容阅读
目的:肾间质纤维化在糖尿病肾病发生中发挥重要作用,肌成纤维细胞是间质纤维化重要要效应细胞,其主要来源于人肾小管上皮细胞的转分化,研究酪氨酸激酶(Janus kinase,JAK)抑制剂托法替尼(Tofacitinib,CP690550)在结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)间充质转分化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)及存在的信号通路JAK3/STAT1在肾间质纤维化中的影响。方法:构建结缔组织生长因子诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)间充质转分化细胞模型,细胞分成CTGF(5μg/L)、CTGF(10μg/L)、CTGF(20μg/L)、CTGF(40μg/L)组,以细胞转分化标志蛋白表达量为指标,观测CTGF诱导作用的量效关系;细胞分成CTGF(12h)、CTGF(24h)、CTGF(36h)、CTGF(48h)组,以细胞转分化标志蛋白表达量为指标,观测CTGF诱导作用的时效关系。CTGF(10μg/L)诱导HK-2细胞,细胞分成Con组(CTGF 0μg/L)、CTGF(10μg/L)组,作用24h后,观测CTGF诱导细胞表型标志物E-Cad、α-SMA蛋白的表达水平。用JAK3/STAT1通路抑制剂CP690550(20μmol/L)干预HK-2细胞,细胞分成(1)对照组(Con),(2)CTGF(10μg/L)诱导组,(3)CTGF+CP690550(20μmol/L)干预组(CTGF+CP),(4)CP690550(20μmol/L)组(CP),用Western blot检测HK-2细胞E-Cad、α-SMA、P-JAK3、P-STAT1蛋白表达水平;Human Lactate酶联免疫(ELISA)检测各组细胞乳酸表达量。结果:(1)CTGF与蛋白表达量效关系:一定浓度(5μg/L、10μg/L)内CTGF诱导E-Cad及α-SMA表达呈剂量依赖性,E-Cad蛋白表达量随CTGF浓度增加而下降,α-SMA蛋白表达量随CTGF浓度增加而上升;CTGF与蛋白表达时效关系:一定时间点(12h、24h)内CTGF诱导E-Cad及α-SMA表达呈时间依赖性,E-Cad蛋白表达量随时间延伸而下降,α-SMA蛋白表达量随时间延伸而上升。(2)CTGF诱导细胞E-cad、α-SMA蛋白表达水平变化:与Con组相比,CTGF组E-Cad蛋白表达量明显下降;与Con组相比,CTGF组α-SMA蛋白表达量明显上升。(3)CTGF诱导和加CP690550抑制剂后P-JAK3、P-STAT1蛋白表达水平变化:CTGF组P-JAK3、P-STAT1蛋白表达量明显高于对照组;CTGF+CP组PJAK3、P-STAT1蛋白表达量较CTGF组明显减少;CP组P-JAK3、P-STAT1蛋白表达量较对照组差异不明显。(4)CTGF诱导和加CP690550抑制剂后E-cad、α-SMA蛋白的表达水平变化:CTGF组E-Cad蛋白表达量较对照组明显下降,CTGF+CP组E-Cad蛋白表达量较对照组下降,CTGF+CP组E-Cad蛋白表达量较CTGF组明显上升,CP组E-Cad蛋白表达量较对照组差异不明显;CTGF组α-SMA蛋白表达量较对照组明显上升,CTGF+CP组α-SMA蛋白表达量较对照组上升,CTGF+CP组α-SMA蛋白表达量较CTGF组下降,CP组α-SMA蛋白表达量较对照组差异不明显。(5)加CP690550抑制剂后乳酸表达量变化:CTGF组乳酸表达量较对照组增高,与CTGF组相比,CTGF+CP组乳酸表达量较CTGF组降低。结论:(1)CTGF能诱导肾小管上皮细胞转分化的产生,活化JAK3/STAT1通路。(2)JAK3/STAT1通路抑制剂CP690550能抑制JAK3/STAT1磷酸化参与肾小管上皮细胞转分化过程。(3)JAK3/STAT1通路抑制剂CP690550能抑制肾小管上皮细胞转分化,表明CP690550具有抗纤维化功能。