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妇科恶性肿瘤严重威胁着女性生理健康,其中子宫颈癌最为多见,占总数的一半以上,其次为卵巢恶性肿瘤,子宫内膜肿瘤,通常把这三种女性生殖器恶性肿瘤称为“妇科三癌”。本研究团队通过一系列相关前期研究中发现了相关新基因F10(GenBank号:AB196290),是一种从葡萄胎与正常早孕绒毛的差异cDNA文库中筛选出的与绒癌发生及侵袭行为相关的新基因[1]。我们发现F10基因在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒癌中均表达且依次表达增强[2]。提示F10基因可能与葡萄胎的恶性变与肿瘤的侵袭性有关。同时,实验数据表明F10基因mRNA在包括卵巢癌、子宫内膜癌组织中均呈阳性表达[3]。此项发现提示我们,F10基因不仅和滋养细胞肿瘤的发生发展密切相关,并且可能通过调节细胞周期、细胞增殖,对其他多种肿瘤的发生发展起着重要作用。但其作用方式与方法需进一步研究揭示。第一部分F10基因在子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌组织中的表达分析目的探究F10基因在不同发病机制妇科肿瘤中的分布情况及对比分析其在恶性肿瘤组织中和正常组织中的表达差异。方法采用免疫组织化学法及逆转录荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测F10基因表达蛋白在子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌组织及相应正常的癌旁组织的表达。结果1、RT-PCR检测子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌中F10基因mRNA的表达分布1.1通过配对样本t检验分析,结果示30对子宫颈癌组织中的F10的平均表达量为2.26±0.52,显著大于子宫颈癌癌旁组织及正常组织中F10的平均表达量0.81±0.15,具有统计学意义(p<0.05)。30对子宫内膜癌组织标本中的F10的平均表达量为8.88±1.60,显著大于癌旁组织及正常组织中F10的平均表达量4.96±0.68,(p<0.05)。20对卵巢癌组织标本中的F10的平均表达量为1.59±0.26,显著大于癌旁组织及正常组织中F10的平均表达量0.65±0.07,(p<0.05)。1.2使用两样本t检验比较宫颈癌患者中10名术前应用新辅助化疗患者与20名术前未应用化疗治疗的患者癌组织中F10基因表达水平,RT-PCR结果显示两组数据之间差异有统计学意义(p=0.04)。免疫组织化学结果显示两组数据之间差异无统计学意义(p=0.99)。2、免疫组织化学法检测子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌中F10基因编码蛋白的表达分布免疫组化检测结果显示:子宫颈癌组织中的F10基因编码蛋白的平均表达量为0.13±0.01,显著大于癌旁组织及正常组织中F10基因编码蛋白的平均表达量0.04±0.01,具有统计学意义。子宫内膜癌组织中的F10的平均表达量为0.06±0.01,显著大于癌旁组织及正常组织中F10基因编码蛋白的平均表达量0.02±0.03,具有统计学意义。卵巢癌组织中的F10基因编码蛋白的平均表达量为0.04±0.00,显著大于癌旁组织及正常组织中F10基因编码蛋白的平均表达量0.02±0.00,具有统计学意义。第二部分细胞免疫荧光法检测F10基因过表达及沉默子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A中细胞增殖及部分细胞周期相关蛋白的表达目的构建F10基因在子宫内膜癌Ishikawa及HEC-1A两种细胞系中过表达与沉默的细胞,对比探究F10基因对子宫内膜癌细胞系增殖速度的影响极其对部分已知细胞周期蛋白和细胞周期调节因子的影响。方法分别构建真核质粒表达载体及RNAi慢病毒载体,设计并构建重组体和F10基因空载体,将重组体和空载体分别转染到Ishikawa和HEC-1A细胞系,经筛选及包装,获得F10基因稳定过表达、沉默及相应空载体转染细胞系。运用RT-PCR法,检测已建立的Ishikawa、HEC-1A细胞系中F10基因表达情况。采用CCK8法绘制细胞生长曲线观察F10基因对子宫内膜癌细胞生长的影响。应用细胞免疫荧光技术半定量子宫内膜癌相关周期蛋白调节因子cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK4、CDK6、P16、P21以及相关细胞周期调节因子:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(PAK4)、增殖细胞核抗原(PCNA)及黏着斑激酶(FAK)的表达差异。结果(1)Ishikawa及HEC-1A细胞系不同处理组间,F10基因过表达组细胞内F10基因表达远高于未处理组。F10基因沉默组细胞内F10基因表达显著低于未处理组。未处理组与F10基因过表达、沉默空载体组细胞间F10基因的表达无显著差别。(2)CCK-8法检测结果示Ishikawa细胞系及HEC-1A细胞系的F10沉默组较未处理组生长速度较缓,F10过表达组较未处理组生长速度增快。F10基因过表达空载体组、F10基因沉默空载体组较未处理组无显著区别。(3)细胞免疫荧光检测结果示:1)细胞周期正性调节因子:与未处理对照组相比,Ishikawa和HEC-1A细胞系中F10基因沉默组CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、CDK6蛋白表达水平显著低于未处理对照组显著降低(p<0.05),F10过表达组CyclinD1、E和CDK2、4、6蛋白表达水平较未处理组显著增高(p<0.05)。2)细胞周期负性调节因子:Ishikawa和HEC-1A细胞系中F10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞P16蛋白表达阳性,且呈上升趋势,沉默组较未处理组、过表达组较未处理组均有统计学差异(p<0.05)。Ishikawa细胞系F10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞P21蛋白表达阳性,沉默组及过表达组细胞P21蛋白表达均高于未处理对照组(p<0.05),沉默组较过表达组P12蛋白表达升高(p<0.05)。HEC-1A细胞系中F10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞P21蛋白表达阳性,且呈下降趋势,沉默组较未处理组、过表达组较未处理组均有统计学差异(p<0.05)。3)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(PAK4):Ishikawa和HEC-1A细胞系F10基因沉默组PAK4蛋白表达水平显著低于未处理对照组(p<0.05),F10基因过表达组PAK4蛋白表达水平显著高于未处理对照组(p<0.05)。4)增殖细胞核抗原(PCNA):Ishikawa细胞系中F10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞PCNA蛋白表达阳性,且呈上升趋势,沉默组较未处理组、过表达组较未处理组均有统计学差异(p<0.05)。HEC-1A细胞系中F10基因沉默组及过表达组PCNA蛋白表达水平均高于未处理对照组(p<0.05),F10基因沉默组PCNA蛋白表达水平低于过表达组。5)黏着斑激酶(FAK):Ishikawa细胞系中F10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞FAK蛋白表达阳性,且呈下降趋势,沉默组较未处理组、过表达组较未处理组均有统计学差异(p<0.05)。HEC-1A细胞系F10基因沉默组及过表达组较对照组,FAK蛋白表达均升高(p<0.05)。F10基因沉默组FAK蛋白表达量较F10基因沉默组升高(p<0.05)。6)Ishikawa和HEC-1A细胞系中F10基因过表达空载体组、F10沉默基因空载体组及未处理组之间检测的所有细胞周期相关蛋白的表达均无显著差异(p>0.05)。结论F10基因在子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌癌组织中的表达明显高于癌旁组织。成功建立并检测F10基因稳定上调、稳定下调的Ishikawa、HEC-1A细胞系,证明F10基因对子宫内膜癌细胞增殖有促进作用。免疫荧光细胞技术证实了 F10基因可促进子宫内膜癌细胞的部分细胞周期正性调节因子增多,部分细胞周期负性调节因子减少,可能通过调节部分细胞周期蛋白表达,加快细胞周期进程,促进子宫内膜癌细胞增殖。