激活标签法筛选内质网质量控制系统的新组分

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蛋白能否行使功能严格依赖其正确的构象和定位。真核细胞内质网中存在着精细的蛋白质量监控机制(Endoplasmic Reticulum Quality Control,ERQC)来确保新生肽链能够正确折叠,并转运至特定位点发挥功能;另一方面,内质网中同时存在着对错误折叠蛋白识别和降解的机制(Endoplasmic Reticulum associated degradation,ERAD)。因此,ERQC和ERAD对维持细胞内蛋白稳态及功能行使具有重要作用。目前鉴定到的参与ERQC和ERAD的关键基因突变在拟南芥中主要有两种表型:早期胚胎致死和无明显生长缺陷。这两种极端表型都不利于对功能基因的克隆和鉴定。研究发现,拟南芥油菜素内酯受体激酶BRI1(Brassinosteroid-Insensitive 1)的等位突变bri1-5(C69Y),由于构象缺陷被ERQC滞留在内质网并通过ERAD降解,从而引起植株矮小的表型。因此,bri1-5是研究拟南芥ERQC和ERAD理想的模式蛋白。本课题以bri1-5为实验材料通过T-DNA介导的激活标签法(Activation Tagging)鉴定拟南芥中参与ERQC和ERAD组分。本课题筛选出的突变文库包含726个株系。根据表型可以分成3类,分别为增强型(叶片更加皱缩)、回复型(类似野生型)以及无显著变化型(和bri1-5突变体类似)。运用Adapter PCR鉴定了其中一个表型增强株系BE2-53(增强皱缩表型)中激活标签的插入位点,并通过RT-PCR进行插入位点附近基因表达量变化的检测。结果显示:激活标签下游基因表达量上调,命名为EOB1(Enhancer of bri1-5 1)。将自身启动子控制的EOB1导入bri1-5突变体中也有类似的表型,暗示该基因的表达上调可能是导致bri1-5表型变化的主要因素。对EOB1的表达模式和定位分析发现EOB1主要在生长发育的旺盛的幼嫩组织中表达并且定位于于内质网附近。分析发现,EOB1基因编码去泛素化蛋白。通过体外实验证明EOB1蛋白具有去泛素化的功能,推测EOB1的上调可能增强了参与bri1-5降解过程关键组分的功能或表达。另外,通过分析eob1突变体对盐胁迫的响应,发现与ERQC其他突变体相似,具有盐敏感表型。综上,利用激活标签的方法筛选出了一个内质网质量控制系统的新组分,并且可能通过去泛素化来调控EARD元件来增强对bri1-5蛋白的降解。
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