[目的]本研究探讨羟基红花黄色素A(hydroxy saffloweryellowA,HSYA)与葛根素(puerarin,PUE)对缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)诱导人脐静脉内皮细胞(The human umbilical vein cell line)EA.hy926凋亡损伤的干预作用,并探索PI3K/Akt信号通路在此干预过程中的调控机制,为中药红花和葛根防治心肌缺血再灌注损伤的临床治疗策略提供理论依据。[方法]1.噻唑蓝(MTT)法检测不同缺氧(8h、12h)、复氧(4h、8h、12h)时间,HSYA(0、10-7、10-6、10-5、104mol/L),PUE(0、10-7、106、10-5、10-4mol/L),LY294002(10、15、20μmol/L)对细胞活力的影响,筛选出合适的缺氧复氧时间以及HSYA、PUE和LY294002干预EA.hy926内皮细胞的浓度。2.蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HSYA、PUE预处理细胞后对B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),活化的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved Caspase-3),活化的天冬氨酸蛋白水解酶-9(cleaved Caspase-9)蛋白表达的影响。3.蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HSYA、PUE预处理细胞后对PI3K/Akt信号通路中p-Akt和Akt蛋白表达水平以及加入PI3K/Akt抑制剂LY294002后对p-Akt和Akt蛋白表达的影响和对B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),活化的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved Caspase-3),活化的天冬氨酸蛋白水解酶-9(cleaved Caspase-9)蛋白表达的影响。4.实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测缺氧12h复氧8h后Bax、Bcl-2基因的表达情况,以及HSYA、PUE预处理细胞后对Bax、Bcl-2等基因表达的影响。5.Hoechest染色检测缺氧12h复氧8h后细胞凋亡的情况以及HSYA、PUE预处理对细胞凋亡的影响。6.流式细胞术检测缺氧12h复氧8h后细胞凋亡的情况以及HSYA预处理对细胞凋亡的影响。[结果]1.缺氧复氧时间与药物浓度筛选 MTT结果显示,与空白对照组比较,缺氧8h、复氧4h、8h、12h,缺氧12h、复氧4h、8h、12h EA.hy926细胞活力均显著下降。其中以缺氧12h、复氧8h后细胞活力下降最为显著(P<0.001),因此以缺氧12h复氧8h作为缺氧复氧的时间点。进行药物预处理时,HSYA的筛选浓度分别为10-7、10-6、10-5、10-4mol/L,实验结果表明与缺氧复氧组相比,10-5mol/L HSYA与10-4 mol/LHSYA预处理细胞后,两个药物浓度均可明显提高缺氧复氧后细胞活力,其中以HSYA(10-5 mol/L)尤为明显(P<0.001),因此10-5 mol/L作为HSYA干预内皮细胞EA.hy926的浓度。PUE筛选浓度分别为10-7、10-6、10-5、10-4mol/L,研究表明与缺氧复氧组相比,PUE 10-7mol/L预处理细胞可明显提高缺氧复氧后细胞活力(P<0.001)。因此10-7mol/L作为PUE预处理EA.hy926细胞的浓度。PI3K抑制剂LY294002浓度筛选为浓度为10、15、20μmol/L,研究结果表明与对照组相比LY294002浓度为10μmol/L时对细胞活力没有影响,因此10μmol/L为LY294002干预细胞浓度。2.缺氧复氧对细胞凋亡的影响 流式细胞术和Hoechest试剂盒用于检测缺氧复氧后EA.hy926内皮细胞的凋亡情况。流式结果显示与对照组相比,缺氧12h、复氧8h后,细胞凋亡明显升高(P<0.001)。Hoechest染色结果显示,与对照组比较,缺氧12h、复氧8h组细胞表现为体积明显缩小的深染核形态,说明缺氧复氧之后细胞凋亡增多。3.缺氧复氧对凋亡基因表达的影响Western blot检测显示,与对照组相比,缺氧12h复氧8h后促凋亡蛋白cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、Bax表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低。Real-time PCR检测显示,与对照组比较,缺氧12h复氧8h抗凋亡基因Bcl-2表达显著下降(P<0.001),Bax表达虽上升,但不具有统计学意义。4.HSYA、PUE预处理对EA.hy926细胞缺氧复氧后凋亡的影响 流式细胞术结果显示,与缺氧复氧组相比,HSYA预处理减少了细胞凋亡,且差异具有统计学意义(P<0.01)。在Hoechest染色中,与缺氧复氧组相比,HSYA预处理组细胞核深染形态明显减少。同时Hoechest结果显示,与缺氧复氧组相比,PUE预处理组内皮细胞核深染形态明显减少。两组实验数据表明,HSYA与PUE预处理细胞可减少缺氧复氧后内皮细胞凋亡。5.HSYA及PUE预处理对EA.hy926细胞缺氧复氧后凋亡基因表达影响Western blot检测显示,与缺氧复氧组相比,HSYA预处理细胞后促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3表达水平明显降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显升高。Real-time PCR检测显示,与缺氧复氧组相比,HSYA预处理下调了 Bax基因表达(P<0.01),上调了 Bcl-2基因表达(P<0.001)。Western blot检测显示,与缺氧复氧组相比,PUE预处理后Bax、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3蛋白表达明显降低,Bcl-2蛋白表达明显升高。Real-time PCR 检测显示,与缺氧复氧组相比,PUE 预处理降低了 caspase-3 的表达(P<0.01),增加了 Bcl-2基因表达(P<0.05)。由此证明,HSYA及PUE对缺氧复氧诱导的EA.hy926细胞凋亡具有抑制作用。6.HSYA与PUE预处理对PI3K/Akt信号通路的影响Western blot检测显示与缺氧复氧组相比,HSYA预处理上调p-Akt的表达,同样与缺氧复氧组相比,PUE预处理后,p-Akt蛋白表达明显升高。由此说明,PI3K/Akt通路介导HSYA与PUE抑制缺氧复氧后EA.hy926细胞凋亡。7.PI3K抑制剂LY294002对PI3K/Akt信号通路以及凋亡蛋白的影响Western blot结果显示,与HSYA预处理组相比,加入PI3K/Akt抑制剂LY294002后p-Akt水平下降,且抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降,促凋亡蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax的表达水平升高。同时Western blot结果显示,与PUE预处理组相比,加入PI3K/Akt抑制剂LY294002后p-Akt水平下降,且抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降,促凋亡蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax的表达水平升高。这表明LY294002抑制PI3K/Akt信号通路介导HSYA和PUE发挥对缺氧复氧诱导内皮细胞凋亡的保护作用。[结论]1.缺氧(12h)、复氧(8h)降低EA.hy926细胞活性;2.HSYA、PUE对缺氧复氧诱导的EA.hy926凋亡具有抑制作用;3.HSYA、PUE对缺氧复氧诱导EA.hy926细胞凋亡的抑制作用与其对PI3K/Akt信号通路的调控有关。