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多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是球状或短杆状的革兰氏阴性菌,根据荚膜抗原可分为A、B、D、E和F五种荚膜血清型,作为一种动物呼吸道的条件性致病菌,当机体受到各种应激因素刺激或损伤时,可引起严重的呼吸道感染。随着我国肉牛养殖业的不断发展,肉牛受到各种应激因素如运输应激、天气突变引起的寒冷应激等,造成肉牛多杀性巴氏杆病的发生,给肉业养殖产业的发展带来了巨大的危害。当动物机体受到寒冷刺激时,会为细菌、病毒等病原微生物的入侵提供了有利条件,诱发多种呼吸道疾病。目前,在寒冷应激条件下,牛多杀性巴氏杆菌病诱导机体肺部感染的原因和机制尚不够清楚,亟需深入研究。因此,本试验为了探讨牛源A型多杀性巴氏杆菌滴鼻感染对寒冷应激小鼠的肺脏及外周血Th17/Treg细胞免疫平衡及相关细胞因子表达的影响及其机制,开展了以下研究:1.通过使用不同浓度(5′10~4 CFU/mL、5′10~3 CFU/mL、5′10~2 CFU/mL)牛源A型巴氏杆菌滴鼻感染小鼠,并进行寒冷应激处理(温度为2-5℃、湿度60%、风速4-5级、每天10h,连续7d),探讨寒冷应激小鼠的牛多杀性巴氏杆菌滴鼻感染模型构建条件。结果表明:5′10~4 CFU/mL Pm致小鼠的死亡率为100%,5′10~3CFU/m L Pm致小鼠的死亡率为90%,5′10~2 CFU/mL Pm致小鼠的死亡率为60%。因此,确定寒冷应激小鼠的牛源A型多杀性巴氏杆菌滴鼻感染模型条件为:牛源A型多杀性巴氏杆菌的滴鼻感染浓度为5′10~2 CFU/mL,寒冷应激条件为2-5℃、湿度60%、风速4-5级、每天10h,连续7d。2.通过对小鼠进行寒冷应激、滴鼻感染牛源A型多杀性巴氏杆菌处理,研究不同处理条件对小鼠死亡率及肺组织病理变化的影响,结果表明:对照组及寒冷应激处理的小鼠无死亡,牛源A型多杀性巴氏杆菌滴鼻感染的小鼠死亡率为20%,两者复合作用组死亡率为60%。同时,对小鼠肺组织进行解剖及病理组织切片结果表明:对照组小鼠肺组织及病理切片显示均正常;寒冷应激组小鼠肺组织外观形态出现出血斑,少量的肺泡腔中出血;巴氏杆菌滴鼻感染组小鼠肺组织表面可见小面积的坏死灶,肺泡腔内有明显出血,肺泡壁融合,有少量炎性细胞浸润;寒冷应激+Pm滴鼻感染复合作用可诱导小鼠肺组织出现大面积的坏死灶和出血点,肺泡壁增厚,且有炎性细胞和淋巴细胞大量浸润。3.通过对各组小鼠分别进行寒冷应激处理、多杀性巴氏杆菌滴鼻感染或两者复合处理后,流式细胞术检测小鼠外周血液中Th17与Treg细胞比例,结果表明:寒冷应激可诱导小鼠外周血Th17细胞显著高于对照组(P<0.05),但显著低于多杀性巴氏杆菌滴鼻感染寒冷应激下小鼠组(P<0.05),而Treg细胞数量无显著变化(P>0.05);多杀性巴氏杆菌滴鼻感染可诱导小鼠外周血Th17细胞显著高于对照组(P<0.05),Treg细胞数量无显著变化(P>0.05);寒冷应激+Pm滴鼻感染可诱导小鼠外周血Th17细胞数量显著升高(P<0.05),Treg细胞数显著下降(P<0.05),造成小鼠外周血的Th17/Treg细胞失衡。因此,在寒冷应激状态下,滴鼻感染牛源A型多杀性巴氏杆菌可引起小鼠外周血Th17/Treg细胞平衡严重失衡。4.通过对各组小鼠分别进行寒冷应激处理、多杀性巴氏杆菌滴鼻感染或两者复合处理后,ELISA法检测各组小鼠外周血Th17/Treg细胞相关的细胞因子(IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β)含量变化。结果表明:寒冷应激组IL-6显著高于对照组(P<0.05),但是显著低于寒冷应激+Pm滴鼻感染组(P<0.05),IL-10、IL-17A显著低于对照组(P<0.05),TGF-β与对照组无显著差异(P>0.05);多杀性巴氏杆菌感染组IL-6显著高于对照组(P<0.05),但是显著低于寒冷应激组、寒冷应激+Pm滴鼻感染组(P<0.05),IL-10显著低于对照组(P<0.05),IL-17A、TGF-β与对照组无显著差异(P>0.05);寒冷应激+Pm滴鼻感染组的TGF-β含量显著低于对照组。说明寒冷应激可诱导多杀性巴氏杆菌滴鼻感染小鼠引起Th17细胞相关因子表达升高,Treg细胞相关细胞因子表达下降,引起Th17/Treg细胞平衡失调,造成炎性反应发生。5.通过对各组小鼠分别进行寒冷应激处理、多杀性巴氏杆菌滴鼻感染或两者复合处理后,荧光定量PCR法检测小鼠肺脏组织中Th17/Treg细胞相关细胞因子(IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β、RORγt、Foxp3)的mRNA表达情况。结果表明:寒冷应激组小鼠肺组织中IL-17A、RORγt mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05),TGF-β、IL-10以及Foxp3与对照组相比显著下降(P<0.05),IL-6表达量与对照组无显著差异(P>0.05);多杀性巴氏杆菌感染组小鼠肺组织IL-17A、RORγt mRNA表达显著高于对照组(P<0.05),IL-6 mRNA表达量与对照组无显著差异,但TGF-β、IL-10以及Foxp3mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05);寒冷应激+Pm滴鼻感染组小鼠肺部组织IL-17A、IL-6、RORγt mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05);抗炎因子IL-10和TGF-βmRNA以及Foxp3 mRNA表达量却显著下降(P<0.05)。因此,寒冷应激、多杀性巴氏杆菌滴鼻感染及寒冷应激+多杀性巴氏杆菌感染均会引起小鼠肺脏Th17/Treg细胞相关细胞因子表达的变化,以寒冷应激+多杀性巴氏杆菌感染影响最为严重,可引起小鼠肺组织炎性反应发生。综上所述,给小鼠滴鼻感染5′10~2CFU/mL浓度的牛源A型多杀性巴氏杆菌,在2-5℃,湿度60%,风速4-5级,连续饲养7d条件下进行寒冷应激处理7天,可成功构建寒冷应激下牛多杀性巴氏杆菌滴鼻感染小鼠模型。同时,在此条件下可诱导小鼠外周血及肺部Th17细胞/Treg细胞免疫平衡失衡,引起Th17细胞数量比例增加,并上调Th17相关的细胞因子(IL-17A、IL-6、RORγt)的表达,降低Treg细胞比例,并下调相关细胞因子(IL-10、TGF-β、Foxp3)的表达,诱导了小鼠全身及肺部炎症反应。