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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)属于柔膜体纲、支原体目、支原体科,主要引起鸡以及其它禽类的慢性呼吸道疾病,特别是在应激状态或存在呼吸道病原体的情况下。鸡毒支原体感染和寄生最重要的步骤是借助于表面的膜蛋白黏附于呼吸道黏膜固有层。为进一步研究鸡毒支原体对宿主的感染和寄生作用,本实验对TpiA和LicA这两种与致病力相关的膜相关酶进行了特性研究,并在实验室原有的转座载体上进行了改造,建立了转座筛选的方法。1.转座筛选方法的建立mini-Tn4001tetM是本实验以前构建的转座载体,以四环素为抗性筛选基因,但由于四环素的筛选范围较窄,不利于转座操作。因此,本实验中将编码四环素的抗性基因替换成编码庆大霉素的抗性基因,并通过抗性基因的PCR扩增、DF1黏附、玻片黏附、SDS-PAGE、Western-blot及质谱鉴定等方法对随机缺失株进行筛选,建立了比较完整的转座筛选方法。2.磷酸丙糖异构酶的生物学特性研究磷酸丙糖异构酶为糖酵解途径中的重要酶。根据Rlow株的磷酸丙糖异构酶的已知序列设计引物,扩增tpiA基因。将点突变后的tpiA克隆入pET28a(+)载体中,进行原核表达,结果呈高效可溶性表达。利用His-Band Resin对上清进行纯化。通过UV交联的方法获得了二聚体磷酸丙糖异构酶,利用纯化的rTpiA免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对纯化的rTpiA进行了酶活性验证,测定出rTpiA相对比活力为3928IU/mg;并确定其最适温度为37℃左右,最适pH为7-8之间,另外TpiA参与了鸡毒支原体对DF1细胞的黏附和入侵。3.LicA的生物学特性研究支原体licA基因编码脂寡糖/脂多糖(Lipooligosaccharide/ Lipopolysaccharide,LOS/LPS)合酶或胆碱激酶,催化合成磷酸胆碱。为深入研究licA基因及其产物的生物学活性,本研究利用Overlap-PCR技术扩增获得鸡毒支原体licA基因,将该基因经酶切克隆入原核表达载体pET32a(+)中,利用IPTG诱导进行原核表达,SDS-PAGE电泳结果显示,LicA呈现包涵体表达,利用His-Band Resin对包涵体进行纯化。将纯化产物作为免疫原腹腔注射BALB/c小鼠,制备获得LicA多克隆抗体。通过对鸡毒支原体不同强弱毒株膜蛋白提取物进行Western-blot检测,发现在所有参试毒株中,LicA表达量恒定,并呈现膜定位特性。这为下一步在体外建立LicA生物学活性检测的模型鉴定了基础。