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背景支架内再狭窄(ISR)是冠心病介入领域的一个难题,药物涂层球囊(DCB)和新一代的药物洗脱支架(DES)仍然存在一定的局限和不足,生物可降解支架(BRS)作为经皮冠状动脉介入治疗(PCI)领域的第四次革命,为患者带来了福音。导师王显教授早期基于心脉病证络风内动病机理论,结合中药配伍减毒原理及现代药理研究进展,选择红豆杉的单体成分紫杉醇和水蛭的单体成分水蛭素组成络风宁0号方用于支架涂层的探索。并陆续成功研发了络风宁0号复方中药单体涂层支架和涂层球囊。现在我们将进一步优化后的络风宁0号支架涂层复合物(紫杉醇和比伐卢定)用于生物可降解支架的研发。目的建立人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)增殖模型,从自噬角度切入,锁定PI3K/AKT/mTOR信号通路,探究络风宁0号支架涂层复合物抗支架内再狭窄的可能机制,为复方中药单体生物可降解支架的研发提供新思路。方法1.HCASMC的体外培养将购买的HCASMC用其配套培养基经规范复苏和传代,建立第4-6代稳定的HCASMC作为后续细胞研究的载体。2.络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖的影响(1)建立凝血酶诱导HCASMC增殖模型选用第4-6代的HCASMC作为研究载体。用不同浓度的凝血酶(0.01 NIH units/mL、0.05 NIH units/mL、0.1 NIH units/mL、0.5 NIH units/mL、1 NIH units/mL、5 NIH units/mL、10NIH units/mL、20NIH units/mL)干预 HCASMC 不同时间(24h、48 h、72 h),采用CCK-8法对干预后的细胞活力进行检测,摸索出最大程度促进HCASMC增殖的凝血酶浓度和干预时间。(2)摸索络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围选用第4-6代的HCASMC作为研究载体。用不同浓度配比的络风宁0号支架涂层复合物,即1μmol/L 的紫杉醇配比不同浓度的比伐卢定(1/256 mg/mL、1/128 mg/mL、1/64 mg/mL、1/32 mg/ml、1/16 mg/mL、1/8 mg/mL、1/4 mg/mL、1/2 mg/mL、1 mg/mL)干预HCASMC4h,采用CCK-8法对干预后的细胞活力进行检测,摸索出使细胞活力保持90%以上,且对细胞无明显抑制作用的络风宁0号的浓度配比。(3)筛选络风宁0号支架涂层复合物抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖的最有效浓度选用第4-6代的HCASMC作为研究载体。先按照前面实验摸索的造模条件建立凝血酶诱导HCASMC增殖模型,再用前面实验摸索出的无毒性浓度范围的络风宁0号对模型进行干预,采用CCK-8法对干预后的细胞活力进行检测,筛选出能够最大程度抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖的络风宁0号浓度配比。3.探究络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖过程中自噬及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响用前面实验得到的络风宁0号支架涂层复合物的最有效浓度对凝血酶诱导的HCASMC 进行干预,采用 Western blot 法检测 LC3、Beclin1、p62、PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达变化,RT-qPCR法检测PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达变化。结果1.经传代培养至4-6代的HCASMC生长状态良好,可用于后续实验。2.络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖的影响(1)建立凝血酶诱导HCASMC增殖模型不同浓度的凝血酶干预HCASMC24 h后的CCK-8结果显示,随着凝血酶浓度的增加,细胞活力逐渐增强,两者成正相关,当凝血酶浓度达到0.05 NIH units/mL时,其对细胞开始显现出明显的促增殖作用,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);不同浓度的凝血酶干预HCASMC48 h后的CCK-8结果显示,与对照组相比,细胞活力均增强。随着凝血酶浓度的增加,从浓度为0.01 NIH units/mL开始,其对细胞显现出明显的促增殖作用,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。当凝血酶浓度达到1 NIH units/mL时,细胞活力达到最强,随后细胞活力随着凝血酶浓度的增加而减弱;不同浓度的凝血酶干预HCASMC72 h后的CCK-8结果显示,不同浓度的凝血酶作用细胞72 h后,均对细胞显现出明显的促增殖作用,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。细胞活力随着凝血酶浓度的增加,先增强后减弱,在凝血酶浓度为1 NIH units/mL时,细胞活力达到最强。考虑到后续实验需在模型的基础上进一步实施,故1 NIH units/mL的凝血酶作用HCASMC48 h可作为凝血酶最大程度促进HCASMC增殖的建模条件。(2)络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围不同浓度配比的络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC4 h后对细胞活力产生不同程度的抑制作用,细胞活力随着比伐卢定浓度的增加而减弱,两者成负相关。当1μmol/L的紫杉醇配比1/64 mg/mL的比伐卢定时,络风宁0号支架涂层复合物对HCASMC的生长开始显现出明显的抑制作用,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。当络风宁0号中比伐卢定的浓度不大于1/128 mg/mL时,其对HCASMC的生长无明显抑制作用,并且可使细胞活力保持90%以上,此时紫杉醇(1μmol/L)和比伐卢定(0 mg/mL-1/128 mg/mL)的浓度配比可作为络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围。(3)络风宁0号支架涂层复合物抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖的最有效浓度不同浓度配比的络风宁0号支架涂层复合物不同程度抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖,与模型组相比,细胞活力随着比伐卢定浓度的增加而减弱,两者成负相关。当1μmol/L的紫杉醇配比1/256 mg/mL的比伐卢定时,络风宁0号支架涂层复合物开始明显抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖,与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。与比伐卢定浓度为1/256 mg/mL的络风宁0号相比,比伐卢定浓度为1/128mg/mL的络风宁0号对凝血酶诱导的HCASMC增殖的抑制作用更显著,差异有统计学意义(P<0.05),可作为络风宁0号支架涂层复合物抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖的最有效浓度,即1 μmol/L的紫杉醇配比1/128 mg/mL的比伐卢定。3.络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖过程中自噬及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响Western blot结果显示,与对照组相比,凝血酶造模组中LC3Ⅱ/Ⅰ的比值和Beclin1的蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),p62、PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比络风宁0号组中LC3Ⅱ/Ⅰ的比值和Beclin1的蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),p62、PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,凝血酶造模组中PI3K、AKT及mTOR的mRNA表达显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,络风宁0号组中PI3K、AKT及mTOR的mRNA表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.凝血酶可能通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制自噬,进而促进HCASMC的增殖。2.络风宁0号支架涂层复合物可能通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路促进自噬,进而抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖,发挥抗支架内再狭窄的作用。