目的腧穴配伍是决定临床疗效的关键因素,选穴不同直接导致针灸效应差异。如电针“足三里”可增强胃动力,电针“天枢”则引起胃舒张,其作用的不同可能是由于针灸刺激作用于大鼠腹部时激活了胃肠的交感神经而抑制胃肠运动,作用于四肢时则激活副交感神经对胃肠运动产生促进作用,而胃肠动力异常是胰岛素抵抗（IR）性肥胖的重要病理因素。然而与此矛盾的是,临床治疗IR性肥胖时经常将腹部和四肢部穴位联合应用。腧穴配伍只有发挥协同效果才能发挥临床的疗效,在肥胖大鼠模型中,不同部位针刺对肥胖胰岛素抵抗有何影响?其配伍治疗是否能增强针刺效应?为进一步研究单纯腹部腧穴配伍、四肢部腧穴配伍对肥胖胰岛素抵抗调节是否具有作用效应,以及腹部联合四肢部腧穴配伍是否存在协同效应?课题采用“标本配穴”电针干预胰岛素抵抗肥胖大鼠模型,运用免疫印迹、免疫组织化学、Rt-PCR等技术,以大鼠摄食量、体重、糖脂代谢相关生化指标和外周胰岛素敏感性的变化为基础,以TLR4/NF-κB信号通路为切入点,探讨不同部位腧穴配伍对脂肪代谢调节作用效应差异,验证腹部与四肢部腧穴配伍应用是否存在的协同效应,阐释“标本配穴”电针可能通过调节TLR4/NF-κ B改善胰岛素抵抗肥胖的机制。本项目的完成将为研究腧穴配伍规律打开新窗口,并为临床运用针灸腧穴配伍防治胰岛素抵抗肥胖及其相关性疾病提供新的科学依据。方法第一阶段为研究比较不同腧穴配伍改善肥胖胰岛素抵抗的不同效应,采用无特定病原体（Specific pathogen free,SPF）级8周龄雄性Wistar大鼠100只,通过随机数字表法选取15只大鼠作为正常组,剩余85只大鼠作为造模组,对各组大鼠用耳标法一一做标记。正常组大鼠给予普通饲料喂养,造模组大鼠给予高脂饲料喂养制造肥胖胰岛素抵抗大鼠模型,各组大鼠给予相应饲料喂养8周。造模完成后,在造模成功后的大鼠中随机挑选60只进行分组,编为模型组、腹部电针干预组、四肢电针干预组、标本配穴电针干预组,每组15只,继续给予以高脂饮食喂养。（1）正常组（n=15）:仅给予普通饲料喂养,无其他干预;（2）模型组（n=15）:模型大鼠,无其他干预;（3）腹部电针干预组（n=15）:模型大鼠,选取关元、中脘,双侧天枢,使用韩氏电针仪,2Hz,1mA,连续波,时间15min,隔日干预1次,每周3次,连续8周;（4）四肢电针干预组（n=15）:模型大鼠,选取双侧足三里、丰隆,使用韩氏电针仪,2Hz,1mA,连续波,时间15min,隔日干预1次,每周3次,连续8周;（5）标本配穴电针干预组（n=15）:模型大鼠,选取关元、中脘、双侧天枢、足三里、丰隆,使用韩氏电针仪,电针参数设置为:频率2Hz,电流1mA,连续波。单次电针时长15min,隔日电针干预1次,每周3次,给与连续8周的电针干预。于高脂饮食造模第8周的最后一天分别测量各组大鼠体质量,然后从正常组中随机选取3只大鼠、造模组中选取15只大鼠进行高胰岛素—正葡萄糖钳夹术实验以检测葡萄糖输注速率（Glucose Infusion Rate,GIR）,通过体质量和GIR判断肥胖胰岛素抵抗大鼠是否造模成功。在电针干预前（第0周）及电针干预后的第2、4、6、8周分别检测各组大鼠体重、进食量、Lee’s指数、外周血空腹血糖、餐后血糖;干预6周时,部分大鼠测定腹腔胰岛素耐量（IPITT）和腹腔糖耐量（IPGTT）。电针治疗完毕后,测大鼠附睾脂肪含量及其脂肪细胞体积、皮下脂肪含量、肝脏重量及脂肪含量。在各组大鼠处死前,用高胰岛素-正葡萄糖钳夹术测定胰岛素敏感性;大鼠处死后即刻心尖取血,采用ELISA法检测血清中IL-1 β、IL-6、TNF-α的含量。最后,取新鲜肝脏组织,检测大鼠肝脏组织中巨噬细胞标志基因F4/80、Cd68和Cd11c表达水平。第二阶段为研究标本配穴改善胰岛素抵抗肥胖大鼠肝脏TLR4/NF-K B信号通路的机制,采用无特定病原体（Specific pathogen free,SPF）级8周龄雄性Wistar大鼠100只,通过随机数字表法选取15只大鼠作为正常组,剩余85只大鼠作为造模组,对各组大鼠用耳标法一一做标记。正常组大鼠给予普通饲料喂养,造模组大鼠给予高脂饲料喂养制造肥胖胰岛素抵抗大鼠模型,各组大鼠给予相应饲料喂养8周。造模完成后,在造模成功后的大鼠中随机挑选60只进行分组,编为模型组、针刺组、沉默组、针刺+沉默组,每组15只,继续给予以高脂饮食喂养。（1）正常组（n=15）:仅给予普通饲料喂养,无其他干预;（2）模型组（n=15）:模型大鼠,无其他干预;（3）针刺组（n=15）:模型大鼠,标本配穴法,选取关元、中脘、双侧天枢、足三里、丰隆,使用韩氏电针仪,2Hz,1mA,连续波,时间15min,隔日干预1次,每周3次,连续8周;（4）沉默组（n=15）:模型大鼠,进行尾静脉注射shRNA沉默TLR4的表达;（5）针刺+沉默组（n=15）:模型大鼠,标本配穴法,选取关元、中脘、双侧天枢、足三里、丰隆,使用韩氏电针仪,2Hz,1mA,连续波,时间15min,隔日干预1次,每周3次,连续8周,同步进行尾静脉注射shRNA沉默TLR4的表达。于高脂饮食造模第8周的最后一天分别测量各组大鼠体质量,然后从正常组中随机选取3只大鼠、造模组中选取15只大鼠进行高胰岛素—正葡萄糖钳夹术实验以检测GIR,通过体质量和GIR判断肥胖胰岛素抵抗大鼠是否造模成功。在电针干预后第8周结束后24小时取大鼠的肝脏组织,应用Western blot法和免疫荧光检测各组大鼠肝脏TLR4、NF-κB和AP-1蛋白的表达情况。结果1.电针对体重、体脂含量及糖、脂质代谢和胰岛素敏感性的影响（1）体重结果显示:干预前与正常组比较,各组大鼠体质量显著偏大（P＜0.01）,提示高脂饲料喂养可成功制备出肥胖大鼠模型。与模型组比较,在干预8周后,腹部电针组、四肢电针组（P＜0.05）和标本配穴电针组（P＜0.01）大鼠的体质量增长缓慢,这提示电针刺激腹部穴位和四肢穴位均能减慢高脂饮食诱导的肥胖大鼠的体重增长。而与腹部电针组和四肢电针组比较,标本配穴电针组减缓大鼠体重增长的效果更为明显（P＜0.05）,进一步表明标本配穴的电针疗效优于单纯的腹部配穴或四肢配穴。（2）Lee’s指数结果显示:干预前与正常组比较,各组大鼠Lee’s指数显著增高（P＜0.01）,与模型组比较,在干预8周后,腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组大鼠的Lee’s指数明显减小（P＜0.05）,说明电针可以有效的改善胰岛抵抗肥胖大鼠的肥胖程度。然而,腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组的大鼠的Lee’s指数差异无统计学意义。（3）内脏白色脂肪重量变化显示:与正常组比较,高脂饲料喂养的四组大鼠（模型组、腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组）的内脏白色脂肪重量明显增大（P＜0.01）,说明高脂饲料喂养能够诱导白色脂肪的增长。与模型组比较,电针干预的腹部电针组、四肢电针组（P＜0.05）和标本配穴电针组（P＜0.01）大鼠的白色脂肪重量明显减小,说明电针能够抑制白色脂肪的堆积。而与腹部电针组和四肢电针组比较,标本配穴电针组对于减少内脏白色脂肪重量增长效果更为明显（P＜0.05）,进一步表明标本配穴的电针疗效优于单纯的腹部配穴或四肢配穴,但腹部电针组和四肢电针组差异无统计学意义。（4）血清TC、TG、FFA、LDL-C、HDL-C含量显示:与正常组比较,其余各组血清中TC、TG、FFA、LDL-C含量显著升高（P＜0.01）,HDL-C的含量显著降低（P＜0.01）;与模型组比较,经过8周干预后,电针干预的三组（腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组）大鼠血清中TC、TG、FFA、LDL-C的含量明显降低,而HDL-C的含量有所升高,差异均有统计学意义。而与腹部电针组和四肢电针组比较,标本配穴电针组对于TC、TG、FFA、LDL-C、HDL-C调节作用更为明显（P＜0.05）,而腹部电针组和四肢电针组之间无统计学差异（P＞0.05）。这说明电针可以调节脂质代谢,而采用标本配穴的方法效果要优于单纯的腹部配穴或四肢配穴。（5）大鼠的血糖代谢的变化显示:在干预前,与正常组比较,使用高脂饲料喂养的四组（模型组、腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组）大鼠空腹血糖（FPG）和餐后血糖（PBG）均有升高趋势,但只有PBG的差异有统计学意义,各组的FPG数据之间的差异无统计学意义。在干预8周后,与模型组比较,电针干预的三组（腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组）FBG和PBG均有降低趋势,但只有PBG的差异有统计学意义,各组的FPG数据之间的差异无统计学意义。电针干预的三组之间比较,虽然有变化趋势,但差异无统计学意义。（6）大鼠的IPGTT变化显示:在干预第6周后,通过腹腔注射葡萄糖检测腹腔葡萄糖耐量,IPGTT整体变化趋势是在开始升高,在30min血糖浓度到达最高,随后降低。从注射后30min起,使用高脂饲料喂养的四组（模型组、腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组）大鼠血糖数值均显著高于正常组（P＜0.01）,表明肥胖胰岛素抵抗大鼠的腹腔葡萄糖耐量下降;而在注射后90min后,腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组的血糖值均显著低于模型组（P＜0.05）,表明电针有利于改善肥胖胰岛素抵抗大鼠的腹腔葡萄糖耐量;在进行干预的三组中,标本配穴电针组效果更为明显,而腹部电针组和四肢电针组之间差异无统计学意义,说明选用标本配穴对于调节肥胖胰岛素抵抗大鼠的腹腔葡萄糖耐量优于单纯的腹部配穴和四肢配穴。（7）大鼠的IPITT变化显示:在干预第6周后,通过腹腔注射胰岛素检测腹腔胰岛素耐量。IPITT整体变化趋势是注射后血糖浓度逐渐降低,在60min到达最低,随后升高。从30min开始,使用高脂饲料喂养的四组（模型组、腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组）大鼠的血糖值均显著高于正常组（P＜0.01）,且血糖下降幅度低,反映肥胖胰岛素抵抗大鼠的腹腔胰岛素耐量下降。而在注射后60min后,腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组的血糖值均显著低于模型组（P＜0.05）,表明电针有利于提高肥胖胰岛素抵抗大鼠的腹腔胰岛素耐量;在进行干预的三组中,标本配穴电针组效果更为明显,而腹部电针组和四肢电针组之间差异无统计学意义,说明选用标本配穴对于调节肥胖胰岛素抵抗大鼠的腹腔胰岛素耐量优于单纯的腹部配穴和四肢配穴。（8）大鼠HOMA-IR指数和ISI指数变化根据显示:与正常组比较,使用高脂饲料喂养的四组（模型组、腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组）大鼠的HOMA-IR指数明显偏高（P＜0.01）,而ISI指数明显偏低（P＜0.01）反映大鼠对胰岛素敏感性下降,出现胰岛素抵抗现象。而经过电针干预后,大鼠的HOMA-IR指数明显偏低（P＜0.05,P＜0.01）,而ISI指数明显偏高（P＜0.05,P＜0.01）。在进行干预的三组中,标本配穴电针组的效果更为明显（P＜0.05）,而腹部电针组和四肢电针组之间差异无统计学意义,进一步表明标本配穴对于调节全身胰岛素敏感的疗效优于单纯的腹部配穴和四肢配穴。（9）大鼠GIR水平变化显示:与正常组比较,使用高脂饲料喂养的四组（模型组、腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组）大鼠的GIR明显偏低（P＜0.01）,且均低于正常组的20%,说明胰岛素抵抗大鼠模型成功。在干预8周后,与模型组比较,经过电针治疗后的三组的大鼠的GIR均高于模型组（P＜0.05,P＜0.01）,说明电针可以调节全身胰岛素敏感。在进行干预的三组中,标本配穴电针组的效果更为明显（P＜0.05）,而腹部电针组和四肢电针组之间差异无统计学意义,进一步表明,标本配穴对于调节全身胰岛素敏感的疗效优于单纯的腹部配穴和四肢配穴。2.电针对血清中IL-1 β、IL-6、TNF-α变化的影响与正常组比较,高脂饲料喂养的四组大鼠（模型组、腹部电针组、四肢电针组和标本配穴电针组）血清中IL-1 β、IL-6、TNF-α的含量明显增多（P＜0.01）,说明肥胖胰岛素抵抗大鼠的炎症水平较高。与模型组比较,电针干预的腹部电针组、四肢电针组（P＜0.05）和标本配穴电针组（P＜0.01）大鼠血清中IL-1 β、IL-6、TNF-α的含量明显减小,说明电针能够抑制外周炎性因子的释放。而与腹部电针组和四肢电针组比较,标本配穴电针组对于IL-1 β、IL-6、TNF-α的调控效果更为明显（P＜0.05）,进一步表明标本配穴的电针疗效优于单纯的腹部配穴或四肢的疗效,但腹部电针组和四肢电针组差异无统计学意义。3.电针对肝脏组织中巨噬细胞标志物表达量的影响与正常组比较,喂食高脂饲料即胰岛素抵抗肥胖模型的大鼠的肝脏组织中巨噬细胞标志物F4/80、Cd68和Cd11c mRNA表达量显著增高（P＜0.01）。与模型组比较,电针干预三组的肝脏组织中F4/80、Cd68和Cd11c mRNA表达量显著降低（P＜0.05,P＜0.01）,而干预的三组电针比较,发现标本配穴组较腹部配穴组和四肢配穴组大鼠的F4/80、Cd68和Cd11c mRNA表达量显著降低（P＜0.05）,而腹部配穴组和四肢配穴组虽然有差异,但差异无统计学意义。4.电针对肝脏重量及肝脏脂肪含量的影响.与正常组比较,喂食高脂饲料四组大鼠的肝脏重量和肝脏脂肪的重量明显增多（P＜0.01）。与模型组比较,电针干预三组的肝脏重量和肝脏脂肪的重量明显减轻（P＜0.05,P＜0.01）,而干预的三组电针比较,发现标本配穴组较腹部配穴组和四肢配穴组大鼠的肝脏重量和肝脏脂肪重量显著减轻（P＜0.05）,而腹部配穴组和四肢配穴组虽然有差异,但差异无统计学意义。5.电针对肝脏中TLR4,NF-κB的表达情况的影响与空白组相比,模型组TLR4,NF-κB表达含量升高（p＜0.05）。而与模型组相比,标本配穴电针组大鼠肝脏TLR4,NF-κB,AP-1含量均明显下降（p＜0.05）,说明标本配穴电针可能通过抑制TLR4抑制肝脏炎症从而发挥改善肥胖大鼠胰岛素抵抗的作用。6.电针对肝脏TLR4,NF-κB,AP-1蛋白表达量影响与空白组相比,模型组TLR4表达含量升高（p＜0.05）,这表明肥胖诱导胰岛素抵抗大鼠免疫被激活。NF-κB,AP-1含量也高于正常组（p＜0.05）,说明大鼠炎症通路被激活,出现肝脏的炎症反应。而与模型组相比,标本配穴针刺组大鼠肝脏TLR4,NF-κB,AP-1含量均明显下降（p＜0.05）,说明标本配穴电针能够抑制大鼠肝脏的免疫反应,减轻炎症。针刺组,沉默组和针刺+沉默组三组之间TLR4,NF-κB,AP-1表达含量无明显差异,说明标本配穴针刺的治疗效应被TLR4沉默所掩盖,针刺抑制炎症可能是通过TLR4发挥作用的。结论1.电针治疗后,TC、TG、FFA、LDL-C含量显著降低,内脏白色脂肪含量减少,提示电针可以改善脂代谢水平。此外,电针还可以改善糖代谢紊乱的问题,虽然肥胖胰岛素抵抗大鼠存在餐后血糖浓度上升,但进行电针治疗后三组大鼠的餐后血糖浓度下降,而在电针干预的三组中又进一步发现,标本配穴组的效果要优于单纯的腹部配穴组和四肢配穴组,从而也反映了标本配穴的优势所在,能够有效提高治疗效应。2.电针干预之后,发现腹部电针组、四肢电针组和标本配穴组的GIR水平上升,且IPGTT和IPITT所测90 min之后的血糖浓度均显著小于模型组,进一步说明电针可以有效的改善胰岛素抵抗状态,提高全身的胰岛素敏感性。在干预的三组进行比较的过程中发现,采用标本配穴的效果优于单纯的腹部配穴和四肢配穴,有效提高外周胰岛素敏感性。3.电针干预可以有效降低外周血中IL-1、IL-6、TNF-α浓度,从而降低全身炎症反应。对于比较不同腧穴配伍对全身性炎症反应的影响结果发现,采用标本配穴比单纯的腹部配穴和四肢配穴效果更为突出,进一步说明不同腧穴配伍的疗效也各有不同。4.电针干预的三组肝脏组织中的F4/80、Cd68和Cd1lc mRNA的表达量显著降低,说明电针可以抑制巨噬细胞的浸润,从而降低炎症反应。而电针干预的三组中,标本配穴组效果明显优于另外两组。5.标本配穴电针治疗后,肝脏TLR4的表达明显降低,表明标本配穴电针能够抑制TLR-4/NF-κB通路改善肥胖大鼠胰岛素抵抗。使用病毒将TLR4沉默后,胰岛素抵抗的各项指标出现了与电针相似的改善,在同时接受TLR沉默以及电针治疗的大鼠中并没有发现更好的疗效,证明电针治疗肥胖大鼠胰岛素抵抗可能是通过抑制TLR4实现的。同样,我们发现模型组大鼠NF-κB和AP-1表达含量升高,这表明胰岛素抵抗肝脏的炎症水平升高,在电针干预后这些指标出现明显下降,且趋势与TLR4一致,更进一步证明了标本配穴电针是通过抑制TLR4发挥改善肝脏炎症,抑制肥胖大鼠胰岛素抵抗的作用机制。综上所述,从理论研究和实验研究等多方面证实,足三里、丰隆、中脘、关元、天枢配伍,固护先天元气的关元和固护后天胃气的足三里治本,中脘健运脾气、丰隆祛湿化痰、天枢升清降浊治标,共奏补益先后天之根本,调理脾胃功能,消脂祛痰之功效,为标本配穴电针治疗胰岛素抵抗奠定了良好的基础。