肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)既往一直被认为是一种只累及运动神经元的神经变性疾病,超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1,SOD1)是导致ALS的常见突变基因,以前的研究认为SOD1基因突变对认知无影响,但我们发现有些SOD1基因突变患者如SOD1G41S和SOD1G41D患有ALS的同时出现认知功能的损害。为了探究SOD1基因突变对认知的影响,我们选择SOD1G41S和SOD1G41D两种突变类型,通过构建携带人源性SOD1WT、SOD1G41S和SOD1G41D的重组腺相关病毒,立体定位注射到小鼠的双侧内侧前额叶皮层,观察对小鼠认知行为的影响。第一部分SOD1WT、SOD1G41S、SOD1G41D重组腺相关病毒的构建及鉴定目的构建携带SOD1WT、SOD1G41S和SOD1G41D的重组腺相关病毒载体。方法人工合成SOD1WT、G41S、G41D、EGFP和m Cherry的c DNA,q-PCR扩增各基因片段;利用Spe I和Eco R I两种核酸内切酶将PT-1727质粒变成线性化载体,并进行q-PCR扩增;将目的基因与线性化载体同源重组,将重组质粒转染stbl3感受态细胞,挑选阳性克隆送测序,抽提重组杆状病毒穿梭载体bacmid。将杆状病毒穿梭载体bacmid转染进入sf9昆虫细胞进行病毒包装,通过纯化、浓缩制备最终的病毒载体,经q-PCR、SDS-PAGE进行病毒滴度、纯度测定,-80℃保存备用。结果成功构建重组病毒,对已合成并经纯化、浓缩的病毒进行纯度、滴度的测定,经检测SOD1WT、SOD1G41S和SOD1G41D r AAV的滴度分别是2.63E+12 vg/L、2.25E+12 vg/L、2.23E+12 vg/L。病毒样品通过SDS-PAGE电泳、银染后显示:与腺相关病蛋白外壳组成比例相当,无明显其他杂蛋白。结论成功构建SOD1WT、SOD1G41S和SOD1G41D重组腺相关载体,病毒纯度、滴度都满足后续试验的要求。第二部分SOD1G41S和SOD1G41D在小鼠内侧前额叶皮层过表达对认知行为影响的相关研究目的探究SOD1G41S和SOD1G41D对小鼠认知行为的影响及相关的神经病理学改变。方法将60nL病毒分别立体定位注射到小鼠(两月龄雄性)的双侧内侧前额叶皮层,将注射携带SOD1WT、SOD1G41S和SOD1G41D重组腺相关病毒的动物设为实验组,注射空白病毒的动物设为CONTROL组(均n=16只),1个月后对小鼠进行矿场实验、Y迷宫自发交替实验、三厢社交实验、追踪条件恐惧实验,观察各组实验动物的行为学改变。通过尼氏染色法和免疫荧光观察目标脑区神经元和神经胶质细胞形态和数量的改变。结果在旷场实验中,SOD1G41D组的运动路程明显低于SOD1WT组(p=0.34);在Y迷宫自发性交替实验中,SOD1WT组及SOD1G41S组的总进臂数、最大交替数和实际交替数明显高于SOD1G41D组(P<0.05);在三厢社交实验中,SOD1G41D组老鼠对陌生鼠无特殊偏爱,存在社交缺陷(p=0.199);在追踪条件恐惧实验中,SOD1G41S组表现出对背景相关恐惧记忆和声音相关恐惧记忆的记忆程度明显强于其它组(p<0.05)。在尼氏染色中,SOD1G41S组和SOD1G41D组都表现明显的神经元数量和形态的改变;在免疫荧光染色中,SOD1G41S组星形胶质细胞和小胶质细胞较其他组数量明显增高。结论SOD1G41S和SOD1G41D可能导致小鼠认知行为的改变,并伴有神经病理学改变。