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目的:抑郁症是一种广泛存在的精神功能障碍疾病,目前有近三成的患者临床治疗无效或效果不佳。近年来虽然从病理生理学的角度对抑郁症的发病机制有了一定认识,但仍然不能令人满意地解释抑郁症疗效不佳的原因。目前多数研究支持抑郁症的海马神经再生障碍假说。杏仁核作为调节情绪的关键脑区之一,已有研究显示抑郁症患者的杏仁核体积减小以及功能异常,因此提示杏仁核神经再生障碍可能是抑郁症形成的又一重要病理机制。沉默信息调节因子1(silent information regulator l,SIRT1)作为NAD+依赖的一种脱乙酰基酶,通过促进海马神经再生改善抑郁情绪障碍,但SIRT1是否通过调控杏仁核神经再生发挥抗抑郁作用尚未见报道。因此,本研究拟采用慢性束缚应激(chronic restraint stress,CRS)诱导的抑郁样大鼠模型,首先利用免疫荧光技术和行为学实验观察抑郁大鼠杏仁核神经再生和抑郁样行为的变化以及电休克治疗(electro-convulsive therapy,ECT)和氟西汀治疗(fluoxetine,FLU)对其的影响;在此基础上,应用基因过表达技术,观察SIRT1上调对抑郁大鼠杏仁核神经再生以及抑郁样行为的影响。本研究将为进一步阐明抑郁情感障碍的“神经再生假说”提供理论依据,为今后治疗抑郁症提供新思路。方法:1.第一部分实验随机分为六个组:(1)正常对照组(Control组):选取8周龄的Sprague-Dawley雄性大鼠,正常饲养;(2)慢性束缚应激组(CRS组):选取同龄Sprague-Dawley雄性大鼠,给予慢性束缚应激3周;(3)慢性束缚应激+电休克治疗组(CRS+ECT组):筛选造模成功的抑郁大鼠,每天一次电休克治疗,连续10天;(4)慢性束缚应激+假电休克组(CRS+Sham ECT组):筛选造模成功的抑郁大鼠,每天一次假电休克治疗,即双耳夹夹住耳朵不给予相应的电流,连续持续10天;(5)慢性束缚应激+氟西汀治疗组(CRS+FLU组):筛选造模成功的抑郁大鼠,灌胃给予氟西汀(10 mg/kg),每天一次,连续30天;(6)慢性束缚应激+生理盐水组(CRS+Nacl组):筛选造模成功的抑郁大鼠,灌胃给予生理盐水(10 mg/kg),每天一次,连续30天。各组分别进行如下实验:(1)行为学实验:建立慢性束缚应激诱导的抑郁样大鼠模型,分别给予氟西汀和电休克治疗后,应用糖水偏好实验(sucrose preference test,SPT)、旷场实验(open field test,OFT)和强迫游泳实验(forced swim test,FST)检测各组大鼠的抑郁行为学指标。(2)免疫组化实验:利用免疫荧光染色细胞增殖标记物Ki67+、未成熟神经元标志物DCX+(doublecortin,微管相关蛋白)检测各组大鼠的杏仁核神经再生水平。2.第二部分实验随机分为四个组:(1)正常对照组(Control组):选取8周龄的Sprague-Dawley雄性大鼠,正常饲养;(2)慢性束缚应激组(CRS组):选取同龄Sprague-Dawley雄性大鼠,给予慢性束缚应激3周;(3)慢性束缚应激+过表达SIRT1组(CRS+AAV-SIRT1组):选取造模成功的抑郁大鼠,将AAV-SIRT1病毒注射至大鼠杏仁核;(4)慢性束缚应激+空载体组(CRS+AAV-EGFP组):选取造模成功的抑郁大鼠,将AAV-EGFP病毒注射至大鼠杏仁核。各组分别进行如下实验:(1)Western-blot和ELISA实验:应用Western-blot方法检测SIRT1蛋白水平,应用酶联免疫分析(ELISA)法检测SIRT1酶活性,以明确各组大鼠中杏仁核的SIRT1蛋白水平以及SIRT1酶活性的变化。(2)行为学实验:在抑郁大鼠杏仁核脑区过表达SIRT1后,检测各组大鼠的抑郁样行为学指标,以评估SIRT1对抑郁样行为的影响。(3)免疫组化实验:在抑郁大鼠杏仁核脑区过表达SIRT1后,应用免疫荧光染色方法检测大鼠的杏仁核神经再生水平,以明确SIRT1对杏仁核神经再生的调控作用。结果:1.行为学实验结果:与正常对照组相比,CRS抑郁组大鼠表现出明显的抑郁样行为,包括糖水偏好百分比明显下降(P<0.001),旷场实验中运动总距离(P<0.001)和中心区域停留时间(P<0.001)显著减少,强迫游泳的不动时间明显延长(P<0.001);与CRS抑郁组相比,电休克组和氟西汀组大鼠糖水偏好百分比显著升高(P<0.001,P<0.01),旷场实验中运动总距离(P<0.001,P<0.01)和中心时间(P<0.01,P<0.05)延长,强迫游泳实验中不动时间明显缩短(P<0.001,P<0.05);治疗十天的电休克组大鼠和治疗三十天的氟西汀组大鼠相比,行为学无明显变化;假电休克组和生理盐水组大鼠与CRS抑郁组大鼠相比,行为学无明显变化;与CRS抑郁组大鼠相比,过表达SIRT1组大鼠的糖水偏好百分比显著升高(P<0.001),旷场实验中运动总距离(P<0.001)和中心时间(P<0.001)延长,强迫游泳时的不动时间明显缩短(P<0.001);空载体组大鼠和CRS抑郁组大鼠的行为学无明显差异。2.Western-blot实验结果:与正常对照组相比,CRS抑郁组大鼠杏仁核中SIRT1蛋白表达量显著降低(P<0.001);与CRS抑郁组大鼠相比,过表达SIRT1组大鼠杏仁核的SIRT1蛋白表达量显著增加(P<0.001);空载体组大鼠和CRS抑郁组大鼠的杏仁核SIRT1蛋白表达量无显著差异。3.酶联免疫分析(ELISA)实验结果:与正常对照组相比,CRS抑郁组大鼠杏仁核中SIRT1酶活性显著降低(P<0.01);与CRS抑郁组大鼠相比,过表达SIRT1组大鼠杏仁核的SIRT1酶活性显著增加(P<0.05);空载体组大鼠和CRS抑郁组大鼠的杏仁核SIRT1酶活性无显著差异。4.免疫荧光实验结果:与正常对照组相比,CRS抑郁组大鼠杏仁核的细胞增殖标记物Ki67+细胞数(P<0.001)和未成熟神经元标志物DCX+细胞数(P<0.001)显著减少;与CRS抑郁组相比,电休克组和氟西汀组杏仁核Ki67+细胞数(P<0.01,P<0.05)和DCX+细胞数(P<0.001,P<0.01)显著增加;治疗十天的电休克组大鼠和治疗三十天的氟西汀组大鼠相比,杏仁核Ki67+细胞数和DCX+细胞数无统计学差异;假电休克组和生理盐水组与CRS抑郁组大鼠相比,杏仁核Ki67+细胞数和DCX+细胞数无统计学差异;与CRS抑郁组大鼠相比,过表达SIRT1组大鼠杏仁核的Ki67+细胞数(P<0.01)和DCX+细胞数(P<0.001)显著增加;空载体组大鼠和CRS抑郁组大鼠的杏仁核Ki67+细胞数和DCX+细胞数无显著差异。结论:1.促进大鼠杏仁核神经再生可以逆转大鼠的抑郁样行为(1)综合糖水偏好实验、旷场实验和强迫游泳三种行为学实验结果,CRS抑郁大鼠较正常对照组表现出显著的抑郁样行为,电休克和氟西汀治疗有助于改善大鼠的抑郁样行为。(2)CRS抑郁大鼠杏仁核中Ki67+细胞数和DCX+细胞数量减少,提示CRS抑郁大鼠的神经再生受损;电休克和氟西汀治疗可以增加抑郁大鼠杏仁核区Ki67+细胞数和DCX+细胞数量,改善CRS大鼠受损的神经再生。(3)电休克治疗十天的抗抑郁疗效达到了氟西汀给药一个月的治疗效果,说明与氟西汀治疗相比,电休克抗抑郁的起效速度更快。2.SIRT1可能通过促进杏仁核神经再生发挥抗抑郁作用(1)CRS抑郁大鼠杏仁核中SIRT1蛋白及其酶活性显著降低,杏仁核中过表达SIRT1明显改善了CRS大鼠的抑郁样行为,首先明确了SIRT1的抗抑郁作用。(2)过表达SIRT1可以部分恢复CRS抑郁大鼠杏仁核减少的Ki67+细胞数和DCX+细胞数,提示SIRT1具有促神经再生的作用。