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隐孢子虫（Cryptosporidium）是一类寄生于多种动物和人的胃肠道的病原。微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）及其Ⅱd亚型是最常见的虫种及亚型。毕氏肠微孢子虫（Enterocyiozoon bieneusi）是最常被报道的微孢子虫种。除了感染人外,E.bieneusi还可以感染野生动物、家养畜禽、伴侣动物等。感染这些肠道原虫后,免疫功能正常的个体一般临床表现为无症状感染,或者自限性腹泻;而免疫功能不健全的个体感染后可导致严重的疾病甚至死亡。这些病原对公共卫生以及人类健康具有较大的威胁。规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR）是原核生物基因组内的一段重复序列,可以转录出特定序列的CRISPR RNA（crRNA）与CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins,Cas）结合并引导其定向寻找目标DNA序列,然后将该序列进行切除。根据Cas蛋白的不同,CRISPR/Cas系统目前主要被用来进行基因编辑和核酸检测。在本研究中,使用IPTG成功诱导重组蛋白LwCas13a在大肠杆菌中可溶性表达,并且通过一系列优化试验最终确定其原核表达条件为:诱导剂IPTG终浓度为0.5 mM,在16℃诱导18 h。本研究利用重组蛋白的6 × His融合标签,通过Ni柱亲和层析法初步纯化得到重组蛋白LwCas13a。并通过梯度浓度咪唑洗脱最终确定了重组蛋白LwCas13a的最佳纯化条件为:40 mM咪唑洗去杂蛋白,500 mM咪唑洗脱目的蛋白。最后使用（?）KTA自动蛋白纯化系统获得纯度较高的重组蛋白LwCas13a。可溶性表达保证了其具有较高的生物活性,可以用来进一步探索Cas13a的独特性质以及各种应用,并为后续研究奠定基础。本研究在C parvum的SSUrRNA位点筛选出了特异性的核酸片段作为Target序列,并据此设计出相应的LwCas13a的crRNA。通过合成两条反向互补的单链crDNA并进行退火以及利用T7体外转录等方法制备出crRNA。通过将RPA反应、T7体外转录反应和CRISPR/Cas13a旁系剪切反应进行整合,建立了一种基于RPA反应和CRISPR/Cas13a系统的“一管法”C.parvum快速检测方法,通过使用通用荧光设备读取荧光强度或者使用蓝光灯照射观察荧光信号来判读结果,具有简便的结果呈现方式。特异性试验表明该方法不和Cryptosporidium的其它种或其它常见的肠道寄生性原虫发生交叉反应,具有较好的特异性。敏感性试验表明该方法可以从粪便中检测到的最低卵囊浓度为每克粪便10个卵囊,具有较高的敏感性。通过在同一批临床样品中同时应用与巢式PCR方法进行了对比,该方法表现出与巢式PCR方法100%的一致性。本研究建立的“一管法”C.parvum快速检测方法是一种高效、特异、稳定的C.parvum快速检测方法,可以在兽医一线临床应用,并且在资源相对匮乏地区同样具有广阔的应用前景。本研究通过比对C.parvum不同亚型的gp60序列,筛选出Ⅱd亚型特异性片段作为Target序列,并设计出C.parvum Ⅱd亚型的特异性crRNA,通过T7体外转录制备并纯化得到纯度较高的crRNA。通过集成 RPA 反应和 Cas 12a 的非特异性剪切反应（recombinase polymerase amplification and Cas12a/crRNAtrans-cleavage,RECTC）,本研究建立了一种检测C.parvum Ⅱd亚型的快速检测方法。该方法通过肉眼观察蓝光下反应产物的荧光信号或检测线判读检测结果,在不具备专业技术人员和昂贵仪器设备的条件下也能完成对临床样品的检测。本研究建立的基于RECTC的检测方法最低可以检测到1.9 × 10-18M的重组质粒或每克粪便10个卵囊,并且不与C.parvum的其它亚型、Cryptosporidium的其它种、其它常见肠道原虫发生交叉反应,具有较高的敏感性与特异性。通过在临床样品中的应用,本研究建立的基于RECTC的检测方法与传统的基于C.parvum gp60位点的巢式PCR方法表现出了 100%的一致性,可以稳定地用于临床样品的检测。本研究通过结合 RPA 和 CRISPR/Cas12a 的旁系剪切能力（recombinase polymerase amplification and the Cas1 2a/crRNA trans-cleavage system,RECTC）,建立了一种可以快速检测样品中E.bieneusi特异性核酸片段的方法。该方法通过肉眼观察蓝光下反应产物的荧光信号或检测线判读检测结果,在不具备专业技术人员和昂贵仪器设备的条件下也能完成对临床样品的检测。本研究建立的基于RECTC的检测方法最低可以检测到3.7 copies/μL的E.bieneu siDNA,并且不与其它常见肠道原虫发生交叉反应,具有较高的敏感性与特异性。通过在临床样品中的应用,本研究建立的基于RECTC的检测方法与传统的基于E.bieneusi ITS序列的巢式PCR方法相比表现出了更高的可靠性,可以稳定地用于临床样品的检测。本研究成功把建立的基于CRISPR/Cas技术的肠道原虫快速检测方法应用于大批量临床样本检测,与PCR产物测序方法进行了对比,并优于后者。在郑州中牟市选择的该奶牛养殖场中,隐孢子虫阳性率较高,E.bieneusi的感染也有发现,提示需要加强饲养管理以及对该寄生虫的防控。