【摘 要】
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我国土壤重金属污染以Pb、Cd较为严重,Cd是生物生长发育过程的非必需元素,是自然界中对动植物和人体危害性最大的重金属种类之一。玉米是一种全球性消费的禾本科类作物,在我国被广泛种植。西南地区是我国玉米主要种植区之一,然而,这些地区土壤中重金属含量较高,主要以Pb、Cd、Cr等污染为主,这对玉米生长及粮食安全带来了极大的风险。已有的研究报道,在Cd胁迫下玉米根部能够将Cd吸收、转运,并储存在根被皮和
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我国土壤重金属污染以Pb、Cd较为严重,Cd是生物生长发育过程的非必需元素,是自然界中对动植物和人体危害性最大的重金属种类之一。玉米是一种全球性消费的禾本科类作物,在我国被广泛种植。西南地区是我国玉米主要种植区之一,然而,这些地区土壤中重金属含量较高,主要以Pb、Cd、Cr等污染为主,这对玉米生长及粮食安全带来了极大的风险。已有的研究报道,在Cd胁迫下玉米根部能够将Cd吸收、转运,并储存在根被皮和外皮质组织中,通过将Cd沉积在根部细胞壁和形成根尖质层来增强玉米对Cd的耐性。然而,目前从分子水平上对玉米响应Cd污染的分子机制还研究甚少。本实验Zm HMA（重金属转运蛋白）家族的两个基因（Zm HMA2-1、Zm HMA2-2）的功能进行进一步分析,研究玉米HMA家族基因对Cd的吸收、转运机制,解析Zm HMA基因响应Cd胁迫的分子机理,对改良现有玉米品种的Cd富集特征,同时为Cd污染土壤的植物修复技术提供一定的参考。本实验通过q T-PCR、亚细胞定位、酵母异源表达、基因敲出技术等,对玉米响应Cd胁迫的两个Zm HMA家族基因的功能进行了初步研究,主要结果如下:1.以课题组前期研究结果得出的对Cd耐性玉米自交系B73为实验材料,参照玉米B73的基因组序列,克隆了两个Zm HMA家族基因,分别编号为Zm HMA2-1（基因号:GRMZM2G175576）、Zm HMA2-2（基因号:GRMZM2G099191）,通过生物信息学分析发现,Zm HMA家族的这两个基因与水稻Os HMA2、3基因,拟南芥At HMA2、3基因亲缘关系较近,其中Zm HMA2-1与Os HMA3基因的同源关系最高,Zm HMA2-2与Os HMA2基因的同源关系最高,蛋白多序列比对结构显示,Zm HMA2-1、Zm HMA2-2与Os HMA2、3,At HMA2、3具有相同的重金转运保守结构域,如TGE（磷酸酶域）,DKTGT（组氨酸激酶域）等。2.通过构建瞬时表达载体在烟草叶片的瞬时表达结果显示,Zm HMA2-1、Zm HMA2-2两个基因均在烟草细胞的细胞膜上表达。Cd胁迫下,对两个基因在B73、MO17中的定量结果显示,在玉米中,这两个基因都对Cd胁迫有相关的响应机制,在一定程度上能够提高玉米对这种环境中的非生物胁迫的防御功能。3.成功构建了两个基因的酵母异源表达载体,并成功转入对Cd敏感的酵母突变菌株,结果显示,在30μmol/L、50μmol/L的Cd Cl2胁迫下Zm HMA2-1基因能够提高酵母突变株的Cd的敏感性,使之变得更敏感,而Zm HMA2-2与转空载的突变酵母株相比,差异并不明显,由此可知,Zm HMA2-1对Cd响应的功能更加明显。4.通过拟南芥同源突变体athma2的表型鉴定,结果显示,突变株与WT（野生型）相比,在25μmol/L、40μmol/L时,对Cd反应极为敏感。构建过表达载体Zm HMA2-1-PRI101、Zm HMA2-2-PRI101转化拟南芥,目前获得了Zm HMA2-2的阳性转化事件,进行Cd胁迫验证,其表型与WT（野生型）相比差异不明显。5.构建了玉米Zm HMA2-1基因敲出载体,以CRISPR/Cas9为载体骨架,以玉米B104为转化受体,目前有21株成活结实。
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