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外源蛋白表达是提高分泌蛋白产量的有效策略之一。地衣芽胞杆菌是公认的生物安全菌株,具有很强的蛋白分泌能力,可作为外源蛋白表达的优良宿主。本文通过对蛋白分泌途径中的重要分泌元件——信号肽酶及信号肽肽酶进行研究,成功构建了一株高效分泌外源蛋白的地衣芽胞杆菌宿主菌△0F-3GS。同时,以纳豆激酶和α-淀粉酶作为靶蛋白,通过构建不同单启动子及串联启动子介导的外源蛋白表达工程菌株,筛选并改造地衣芽胞杆菌蛋白表达系统的高效启动子。信号肽酶负责切割目标蛋白N端的信号肽,促使目标蛋白成功跨膜。在地衣芽胞杆菌△0F-3的基础上,通过整合表达信号肽酶基因sipV,成功构建了信号肽酶sipV过表达菌株△0F-3-GV,随后将纳豆激酶表达载体pHY300-P43-NK电转化至上述过表达菌株中,并进行纳豆激酶发酵分析。结果表明,与对照组相比,工程菌株的纳豆激酶酶活达到35.60 FU/mL,比对照组提高了 16%。信号肽肽酶负责降解残留在细胞膜上的信号肽,地衣芽胞杆菌中存在两种信号肽肽酶基因sppA和tepA。在地衣芽胞杆菌△ 0F-3的基础上,分别整合表达信号肽肽酶基因sppA和tepA,成功构建了信号肽肽酶过表达菌株△0F-3GS和△0F-3GA,随后将纳豆激酶游离表达载体pHY300-P43-NK和α-淀粉酶游离表达载体pHY-P43-amyL分别电转化至上述过表达菌株中,发酵结果表明,sppA过表达菌株△ 0F-3GS的纳豆激酶和α-淀粉酶酶活显著提高,与对照组△ 0F-3相比分别提高了 18%和43%。而tepA过表达菌株△ 0F-3GA纳豆激酶酶活相比于对照菌株基本没有变化,α-淀粉酶酶活仅提高了 12%。上述结果表明,地衣芽胞杆菌蛋白分泌过程中,信号肽肽酶SppA发挥着主要的信号肽肽酶功能。在实验室已有的地衣芽胞杆菌DW2转录组数据基础上,选取了 15个启动子,将其替换实验室保存的纳豆激酶表达载体pHY300-P43-NK中的P43启动子,构建不同启动子介导的纳豆激酶游离表达载体,并分别转入地衣芽胞杆菌A0F-3。发酵实验结果表明,较高酶活菌株的启动子分别是Prpsn、PcstA和Pveg,其中Pveg介导的纳豆激酶酶活最高,酶活达到37.84 FU/mL,但是与P43介导的纳豆激酶酶活(34.39 FU/mL)相比没有显著性差异变化。在纳豆激酶游离表达载体pHY300-P43-NK和α-淀粉酶游离表达载体pHY-P43-amyL的基础上,通过筛选稳定期启动子Pykza、PgsiB和PylB,构建了串联启动子表达载体Pykza-P43-NK,PgsiB-P43-NK,PylB-P43-NK,Pytza-P43-amyL,PgsiB-P43-amyL,PylB-P43-amyL,并分别转入上述信号肽肽酶过表达菌株△ 0F-3GS。发酵实验结果表明,上述串联启动子介导的α-淀粉酶产量相比于对照组均显著提高,其中PylB-P43所介导的α-淀粉酶的酶活最高,与对照组△ 0F-3GS/pHY-P43-amyL 相比提高了 101%,与出发菌株△ 0F-3/pHY-P43-amyL 相比则提高了 272%,酶活达到296.35 U/mL。然而,串联启动子介导的纳豆激酶的产量相比于对照组没有明显变化。