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癌症免疫疗法(cancer immunotherapy)被评为2013年十大科学突破之首,溶瘤病毒是其重要分支,具有疗效好,副作用小和防止复发等优点。2003年中国批准世界首个溶瘤病毒。2015年美国食品及药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的第一个溶瘤单纯疱疹病毒(Oncolytic herpes simplex virus,oHSV)药物“T-VEC”经过改造后大大提高了其特异性和靶向性,并且在晚期黑色素瘤患者中的Ⅰ期和Ⅱ期试验结果非常令人鼓舞。US12是编码一种多态性蛋白—ICP47(infected cell polypeptide 47)的立即早期基因,可在HSV感染过程中抑制病毒抗原呈递,促进HSV免疫逃逸。ICP47可以直接与抗原加工相关转运体(transporter associated with antigen processing,TAP)结合,限制病毒抗原转运,导致空载体的MHC-I类分子的发生。HSV通过阻断病毒抗原进入内质网(ER),可以避免细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的杀伤作用,从而导致HSV免疫逃逸,在宿主细胞中建立感染的机制。目前,调控US12基因转录的研究尚未见报道。本研究拟分析US12基因转录调控序列,并进一步构建删除US12的oHSV,为验证其对卵巢癌细胞的杀伤作用和开发新型溶瘤病毒抗癌药物提供理论及实验依据。目的:鉴定US12基因的转录调控序列(TRS)和转录调控因子(TRF),进而对其加以改造,为构建删除US12基因的新型oHSV并用于卵巢癌的治疗奠定基础。方法:1.序列比对确定新毒株HSV-1-LXMW的US12基因的转录调控序列;2.生物信息学分析US12基因的转录调控序列;3.重组删除US12的HSV;4.筛选并鉴定重组HSV。结果:首先确定了本课题组前期分离的HSV-1毒株(HSV-1-LXMW)中US12基因潜在转录调控序列。通过系统发育进化分析发现HSV-1-LXMW的转录调控序列与英国的HSV-1-CR38和HSV-1-17有较高的亲缘性。采用权重矩阵的程序匹配软件,鉴定了 12株HSV US12的转录调控序列及转录调控因子(c-Rel、Elk-1、Pax-4、Oct-1、CF2-II、E74A、StuAp)。有研究表明c-Rel和Oct-1在HSV感染过程中分别具有免疫逃逸和影响病毒复制的生物学功能,并且根据文献分析,本研究进一步推测了 c-Rel激活ICP47介导的免疫逃逸导致HSV-1脑炎的新机制。通过多序列对比分析的进一步验证表明,9株HSV-1的US12转录调控序列含14个保守区,3株HSV-2的US12转录调控序列含7个保守区,且转录因子HNF-4在HSV-1和HSV-2中均具有保守性。这些发现增加了对HSV生物学和溶瘤病毒治疗中转录调控的新理解。同时,本研究用本课题组分离的中国人HSV-1毒株,分析并鉴定US12的转录调控功能后,部分构建了新型的△US12-oHSV,为卵巢癌溶瘤HSV的构建和专利申请奠定了基础。结论:1.通过对US12基因的转录调控区序列分析,发现HSV-1-LXMW与英国HSV-1-CR38、HSV-1-17 亲缘性近。2.鉴定了 12株HSVUS12的转录调控序列及转录调控因子且分析了与其功能相关的保守性。转录因子c-Rel和Oct-1在HSV感染过程中分别具有免疫逃逸和影响病毒复制的生物学功能,根据文献分析,本研究进一步推测了 c-Rel激活ICP47介导的免疫逃逸导致HSV-1脑炎的新机制。3.通过CRISPR/Cas9技术,使用本课题组分离的中国人HSV-1-LXMW毒株,部分构建了新型的△ US12-oHSV,为开发卵巢癌新型溶瘤病毒抗癌药物提供了有益参考。