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第一部分CACNA1H在DOX导致的心肌损伤中表达升高目的:阿霉素（DOX）是一种有效的广谱蒽环类抗肿瘤药物,但会导致剂量依赖性的不可逆的心肌细胞受损,使其应用受到很大限制。心肌细胞作为终末分化细胞,不具备分裂增殖的能力,在受到刺激导致心肌受损时,会发生代偿性肥大,最终导致心功能下降和HF。在这个过程中,心肌细胞核内基因表达发生改变,出现胎儿基因的重新表达。T型钙离子通道仅表达于发育阶段的心室肌细胞,在成熟心肌细胞中不表达,其核心结构是α1亚基,在哺乳动物体内有3种不同的α1亚基基因:CACNA1G、CACNA1H、CACAN1I。本部分研究旨在小鼠体内构建DOX导致的心肌损伤模型,并检测T型钙离子通道核心亚基之一的CACNA1H的表达变化。方法:选择12只7周龄的C57BL/6雄性小鼠,随机分为实验组和对照组,每组6只。实验组单次腹腔注射15 mg/kg DOX,对照组注射等量的生理盐水。每天测量所有小鼠体重,5天后通过超声成像系统评估小鼠心功能,留取心脏组织称重后进行天狼星红染色和HE染色,评估DOX对小鼠心脏结构的损伤,通过RTPCR和免疫组织化学染色评估CACNA1H在两组小鼠间的表达差异。结果:与对照组小鼠相比,DOX处理组的小鼠体重和心脏重量显著减轻,左室射血分数和缩短分数值显著降低（P<0.05）;天狼星红染色显示DOX处理组的小鼠心肌纤维排列紊乱,胶原沉积;HE染色显示DOX处理组小鼠心肌细胞排列紊乱,液泡化心肌细胞的比例较对照组小鼠显著增多（P<0.05）;RT-PCR和免疫组织化学染色结果显示,DOX处理组小鼠心脏组织中CACNA1H的m RNA和蛋白表达水平均显著高于对照组（P<0.05）。结论:DOX可以损伤小鼠心功能,破坏小鼠心肌细胞排列结构。CACNA1H在DOX导致的心脏损伤中表达增多,可能参与了DOX导致的心脏毒性作用。第二部分CACNA1H是DOX导致心脏毒性作用的关键分子目的:DOX可以通过多种途径导致心肌细胞凋亡,而内质网应激与细胞凋亡关系密切。有研究称内质网应激相关蛋白的m RNA水平在心力衰竭患者体内有所上升,抑制内质网应激可以缓解心肌肥厚的发生。但内质网应激在DOX心脏毒性中的作用研究较少。内质网作为细胞内最大的钙离子库,不仅可以调节细胞内钙离子浓度,其结构与功能状态也受到细胞内钙离子浓度的影响。本研究第一部分中发现T型钙离子通道亚型之一CACNA1H在DOX导致的心脏损伤中表达增多,本部分将通过抑制CACNA1H探究其在DOX导致心脏毒性中的作用,并研究CACNA1H与内质网应激的关系。方法:前期实验显示10 mg/kg ABT-639可以有效抑制DOX导致的CACNA1H表达升高。购买24只7周龄的C57BL/6雄性小鼠进行动物实验,随机分为4组,control组、DOX组、ABT组和DOX+ABT组,每组6只。DOX组和DOX+ABT组给予单次腹腔注射15 mg/kg DOX,control组和ABT组给予等量的生理盐水腹腔注射,从当天起连续5天,ABT组和DOX+ABT组每天单次给予10 mg/kg ABT-639灌胃处理,control组和DOX组每天给予等量的生理盐水灌胃处理。每天测量各组小鼠体重,5天后通过超声成像系统评估小鼠心功能,留取心脏组织称重后进行天狼星红染色和HE染色评估DOX对小鼠心肌细胞的损伤,通过RTPCR和免疫组织化学染色评估CACNA1H在各组小鼠间的表达差异,通过TUNEL染色评估小鼠心肌细胞的凋亡情况,通过CHOP的免疫荧光染色和Western Blot评估小鼠心脏组织中内质网应激情况。结果:RT-PCR和免疫组织化学结果显示,DOX处理组小鼠心脏组织中CACNA1H的m RNA和蛋白表达水平均显著高于对照组（P<0.05）,加入ABT-639可以显著抑制DOX导致的CACNA1H表达升高（P<0.05）;ABT+DOX组小鼠体重较DOX处理组有所增加,左室射血分数和缩短分数较DOX处理组显著升高（P<0.05）;天狼星红染色见ABT+DOX组小鼠心肌纤维排列整齐,HE染色显示ABT+DOX组小鼠心肌细胞排列有序,液泡化心肌细胞比例较DOX处理组显著降低（P<0.05）;TUNEL染色显示DOX处理组小鼠心脏组织中凋亡的心肌细胞较对照组显著增多（P<0.05）,ABT+DOX组较DOX处理组显著减少（P<0.05）;使用Western Blot发现DOX处理组小鼠心脏组织中内质网应激标志蛋白（pPERK、ATF6、GRP78）、参与内质网应激相关凋亡通路的蛋白（ATF4、CHOP）及凋亡蛋白（caspase12）的表达较对照组显著增多（P<0.05）,ABT+DOX组小鼠心脏组织内的这些蛋白表达水平较DOX处理组显著降低（P<0.05）;免疫荧光染色结果显示,DOX处理组小鼠心脏组织中CHOP阳性的细胞较对照组显著增多（P<0.05）,ABT+DOX组较DOX处理组显著减少（P<0.05）。结论:DOX可以通过导致心肌细胞凋亡和内质网应激导致心脏毒性作用;抑制CACNA1H可以减轻DOX的心脏毒性作用。第三部分CACNA1H通过内质网应激通路参与DOX导致的心肌细胞凋亡过程目的:DOX非特异性地损伤心肌细胞膜,使钙离子经非特异性通道内流,导致钙超载,从而导致心肌损伤的发生。外源性化合物可以使内质网（ER）膜上的钙通道发生变化,使ER出现钙耗竭或钙超载的现象,从而导致ER功能紊乱,最后发生不可逆的细胞凋亡。本部分研究旨在利用内质网应激抑制剂探索CACNA1H是否可以通过内质网应激通路影响心肌细胞的凋亡。方法:体外培养大鼠心肌细胞细胞（H9C2细胞）,同步化处理后,采用1μM DOX干预细胞12小时（DOX处理组）,在此基础上,给予10μM CACNA1H抑制剂ABT-639处理细胞（ABT+DOX组）,另一组给予30μM内质网应激抑制剂UR-906处理细胞（UR+DOX组）。通过CCK-8实验检测各组细胞的生存情况,使用RT-PCR检测各组细胞内CACNA1H的m RNA表达情况。通过免疫荧光染色评估各组细胞内CHOP的蛋白表达情况,使用Western Blot评估各组细胞中内质网应激和细胞凋亡相关标志物的表达情况。分别使用DHE探针和Fluo 4-AM探针评估各组细胞中活性氧的产生情况和细胞内钙离子浓度的差异。结果:CCK-8结果显示,1μM DOX显著降低H9C2细胞的细胞活性,而10μM ABT-639和30μM UR-906可以显著改善DOX导致的细胞损伤;RT-PCR结果显示,ABT-639可以显著抑制DOX导致的CACNA1H表达升高（P<0.05）;免疫荧光染色结果显示,DOX处理使H9C2细胞中CHOP蛋白表达显著升高（P<0.05）,使用ABT-639和UR-906可以显著抑制DOX导致的CHOP蛋白表达升高（P<0.05）,且UR-906作用更强;Western Blot结果显示DOX处理组相比对照组,细胞中内质网应激标志蛋白（p-PERK、ATF6、GRP78）、参与内质网应激相关凋亡通路的蛋白（ATF4、CHOP）及凋亡蛋白（caspase12、caspase3）的表达显著升高（P<0.05）,使用ABT-639和UR-906可以显著抑制DOX导致的相关蛋白表达升高（P<0.05）,且UR-906作用更强;DHE染色结果显示,DOX处理组细胞内活性氧的产生相比对照组显著增多（P<0.05）,使用ABT-639和UR-906可以显著抑制DOX导致的活性氧产生增多（P<0.05）,且UR-906作用更强;Fluo 4-AM染色结果显示,DOX处理组细胞内钙离子的浓度相比对照组显著升高（P<0.05）,ABT-639和UR-906可以显著抑制DOX导致的钙离子浓度升高（P<0.05）,且ABT-639作用更强。结论:DOX导致的CACNA1H上调可以加重心肌细胞中内质网应激程度,导致心肌细胞凋亡。