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柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5,CVB5)属于小RNA病毒科肠道病毒属,无包膜的单股正链RNA病毒。CVB5的基因组分为5’端非翻译区(untranslated region,UTR)、3’-UTR 和 P1、P2、P3 蛋白编码区。P1 区编码 VPI、VP2、VP3 和 VP4 衣壳蛋白,P2 和 P3 区编码 2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D非结构蛋白。CVB5主要通过呼吸道和消化道侵染宿主,能够引起手足口病(HFMD)、无菌性脑膜炎、心肌炎、Ⅰ型糖尿病等多种疾病。近年来,CVB5在亚太及欧美地区多次引起HFMD和无菌性脑膜炎暴发流行,在中国也呈现出日益活跃的趋势。目前,由于CVB5的研究较少,病毒的感染及复制机制尚不清楚,通常病毒的非结构蛋白在病毒增殖及宿主致病过程中发挥着重要的作用。病毒通过调控自身蛋白的表达来逃逸宿主细胞的免疫应答,从而促进病毒的复制和持续性感染。本课题旨在研究CVB5对宿主细胞干扰素β的影响及发挥主要作用的非结构蛋白。本研究工作主要包括三个部分:1、柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白真核表达载体的构建及在HEK293T细胞中的表达将实验室保存的CVB5病毒接种在HEK239T细胞上,进行增殖。其结构蛋白VP1测序结果与GenBank中已上传CVB5序列比对,结果与序列的相似度最高(99%),因此根据序列中的非结构蛋白的碱基序列来设计本实验室的CVB5非结构蛋白扩增引物。CVB5提RNA逆转录扩增非结构蛋白,由于非结构蛋白3B的碱基序列太短,故将其与3A蛋白共同扩增(即3AB)。将六种非结构蛋白(2A、2B、2C、3AB、3C、3D)的基因插入标签载体pcDNA3.1-2Flag 上,构建真核表达载体(pcDNA3.1-2A/2B/2C/3AB/3C/3D-2Flag)。通过 PCR、双酶切及测序分析来鉴定六种非结构蛋白的真核表达载体构建成功。将六种真核表达载体分别转染至HEK293T细胞,通过Western blot检测所构建的真核表达载体能够在真核细胞中稳定表达。2、柯萨奇病毒B组5型对HEK293T细胞干扰素β的不同水平的影响HEK293T细胞培养,共转转录因子表达质粒(pIFN-β-Luc)与报告基因质粒(pRL-TK),质粒转染24h后分别接种不同感染复数(0MOI、0.01MOI、0.1MOI)的CVB5,12h后收获样品,进行双荧光素酶检测,分析CVB5在启动子水平对IFN-β的影响。HEK293T细胞培养,接种不同感染复数(0 MOI、0.01 MOI、0.1 MOI)的CVB5,6h、12h后收获样品,提RNA逆转录,通过实时荧光定量PCR检测,分析CVB5在mRNA水平对IFN-β的影响,及CVB5对IFN-β上游转录因子IRF-3的mRNA水平的影响。HEK293T细胞培养,接种不同感染复数(0 MOI、0.01 MOI、0.1 MOI)的CVB5,12h后收获样品,通过WB检测,分析CVB5对IFN-β及IRF-3蛋白表达的影响。3、对HEK293T细胞干扰素β发挥作用的具体CVB5非结构蛋白的探索HEK293T细胞培养,分别转染六种非结构蛋白的真核表达载体,转染24h后收获样品,提RNA逆转录,通过实时荧光定量PCR检测,分析CVB5中对IFN-β mRNA水平发挥主要作用的非结构蛋白。结果:CVB5六种非结构蛋白中3AB、3C、3D均能对细胞IFN-β mRNA水平产生抑制作用,其中3AB蛋白对IFN-β mRNA水平的抑制作用最强。分析CVB5中对IFN-β上游转录因子IRF-3 mRNA水平发挥主要作用的非结构蛋白。结果:CVB5六种非结构蛋白均能对IRF-3 mRNA水平产生抑制作用,其中3AB、3C、3D蛋白对IFN-β mRNA水平的抑制作用最为显著。本文成功构建了 CVB5的非结构蛋白真核表达载体,并且能够在HEK293T细胞中稳定表达。确定了 CVB5对IFN-β的启动子水平无影响,对IFN-β的mRNA水平有明显的抑制作用。通过进一步检测,确定CVB5对IFN-β上游转录因子IRF-3的mRNA水平同样具有抑制作用。CVB5对IFN-β及IRF-3的mRNA水平起到抑制作用的主要非结构蛋白为3AB、3C和3D。这些结果为进一步研究CVB5非结构蛋白的功能及病毒蛋白对天然免疫反应的调节奠定基础。