论文部分内容阅读
目的:初步探究柯萨奇病毒B组3型(Coxsackies virus,CVB3)的结构蛋白VP2对心肌细胞的影响,为研究CVB3引起病毒性心肌炎的致病机制提供理论基础。方法:1.以CVB3病毒RNA为模板,逆转录为cDNA,PCR扩增VP2基因,同时构建蛋白融合表达质粒pCAG-2Strep-Flag-VP2,pCAG-2Strep-Flag-VP2-APEX2和腺病毒载体pAdTrack-2Strep-Flag-VP2,pAdTrack-2Strep-Flag-VP2-APEX2,并包装成重组腺病毒颗粒Ad-VP2和Ad-VP2-APEX2,扩增后测定重组腺病毒颗粒的滴度;2.原代心肌细胞的提取:取新生SD大鼠(1-3天)心肌组织,研磨至1-3mm~3的组织块,用0.1%的胰酶消化8-10次,每次10分钟,离心收集细胞,差速贴壁2h后获得搏动的心肌细胞;3.以Ad-VP2(MOI=10)感染心肌细胞后观察光学显微镜下细胞形态变化;4.通过CCK8方法检测Ad-VP2(MOI=10)感染心肌细胞后0 h,24 h,48h,72 h的细胞增殖变化;5.Ad-VP2-APEX2(MOI=10)感染NRVCs,利用APEX2技术筛选与之相互作用的宿主蛋白,并利用免疫荧光和免疫共沉淀法再次验证VP2蛋白与宿主蛋白的相互作用;6.利用Annexin V/FITC标记流式细胞术检测Ad-VP2重组腺病毒对心肌细胞凋亡的影响;7.通过DCFH-DA探针标记检测细胞内活性氧(Reactive oxygen,ROS)水平;8.利用Western blot检测Ad-VP2重组腺病毒感染NRVCs后S100A6,β-Catenin和c-Myc的蛋白表达量。结果:1.成功获得表达CVB3 VP2蛋白的重组腺病毒Ad-VP2和Ad-VP2-APEX2;2.Ad-VP2感染心肌细胞72 h后,细胞增殖能力降低;感染第5天后开始出现细胞病变效应,感染第14天后细胞死亡;3.通过APEX技术筛选到41个可能与VP2相互作用的宿主蛋白,进一步利用免疫荧光和免疫共沉淀证明宿主蛋白S100A6与VP2蛋白具有相互作用;4.Ad-VP2感染心肌细胞24 h、48 h,72 h后,随着感染时间的延长,细胞凋亡率增加;5.Ad-VP2感染细胞0 h、24 h、48 h和72 h后,检测到细胞内ROS水平升高,其中感染48 h后ROS水平达到峰值;6.Ad-VP2感染细胞后,细胞内S100A6、β-Catenin和c-Myc蛋白表达量增加。结论:CVB3病毒VP2蛋白可能通过以下两种途径引起细胞病变效应,导致心肌细胞死亡:(1)诱导细胞凋亡;(2)VP2与钙连接蛋白S100A6相互作用激活了β-Catenin/c-Myc通路,引起细胞内氧化应激,从而导致心肌细胞损伤。