【摘 要】
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Her2/neu原癌基因的过表达频繁发生于乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和胃肠道肿瘤,其在乳腺癌的过表达是预后不良的相关因素。树突细胞是迄今为止发现的最强大的抗原递呈细胞,是免疫应答的发起者。目前,用编码肿瘤相关抗原的基因在体外对树突细胞进行遗传改造后回输到肿瘤患者体内是肿瘤免疫治疗中一项很有前途的方案。本研究在临床前水平对这一方案进行了实践。我们首先利用报告基因比较了4种体外改造树突细胞的方法
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Her2/neu原癌基因的过表达频繁发生于乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和胃肠道肿瘤,其在乳腺癌的过表达是预后不良的相关因素。树突细胞是迄今为止发现的最强大的抗原递呈细胞,是免疫应答的发起者。目前,用编码肿瘤相关抗原的基因在体外对树突细胞进行遗传改造后回输到肿瘤患者体内是肿瘤免疫治疗中一项很有前途的方案。本研究在临床前水平对这一方案进行了实践。我们首先利用报告基因比较了4种体外改造树突细胞的方法,包括脂质体转染、电穿孔转染、重组2型腺相关病毒转导和重组慢病毒转导。其中我们发现重组慢病毒的转导效率最高,在此基础上,对慢病毒转导方案的一些细节进行了优化,进一步提高了转导效率（最高达70%）。接下来我们包装了携带部分大鼠neu基因（胞外区和跨膜区）的重组慢病毒,在体外对树突细胞进行了转导,并通过一系列体内体外实验对其功能进行了研究。我们发现,经过Her2/neu基因改造的树突细胞（简写为DCneu,下同）在镜下外观,表面标记,抗原捕获能力和抗原递呈能力与未经改造的树突细胞（简写为DCctrl,下同）没有明显差别,提示慢病毒感染不会影响树突细胞的主要功能,也不会促进DC成熟。动物实验表明,DCneu能有效预防和治疗Her2/neu过表达肿瘤。在我们的实验中,仅仅一次低剂量的皮下免疫接种（1.5×105／只）就使该实验组的5只小鼠在Her2/neu过表达肿瘤细胞两次攻击（2×105／只）后至今（>180天）仍然保持健康无瘤状态；与之相比,注射了DPBS的对照组小鼠（5只）,注射了DCctrl的小鼠（5只）和注射了DCegfp的小鼠（5只）均在肿瘤细胞攻击后31天内就已全部发生了肿瘤。当我们采用Her2/neu表达阴性的肿瘤细胞进行攻击时,3组小鼠（3只／组）在攻击后12-16天之间都发生了肿瘤。说明DCneu的免疫预防作用是Her2/neu特异的。在肿瘤治疗实验中,我们先用Her2/neu过表达肿瘤细胞对小鼠进行接种（2×105／只）,待肿瘤生长7天后再用DPBS（6只）,DCegfp（7只）和DCneu（6只）进行治疗（2×105/只）。我们发现,与DPBS组和DCegfp组相比,DCneu组的肿瘤生长受到了显著的抑制,观察期结束时（肿瘤接种后19天）肿瘤平均体积分别为976.64mm3,592.63 mm3和132 mm3。体外实验发现,DCneu免疫小鼠的血清neu抗体水平显著升高,抗体水平随时间逐渐下降,但相比DPBS免疫小鼠仍然维持在一个较高水平（DC免疫后101天）。在DCneu免疫小鼠的脾淋巴细胞中检测到CD4+和CD8+T细胞扩增。与DCctrl相比,经过DCneu治疗的小鼠脾淋巴细胞在体外受到B16ne。刺激时能分泌更多的IFN-γ。这些结果说明DCneu能有效刺激neu特异的体液免疫和细胞免疫反应,与动物实验的结果相一致。最后,我们发现经DCneu治疗的小鼠肿瘤组织中neu表达水平比DPBS对照组下降更多,提示可能来自DCneu的治疗效果。此外,上述两种小鼠肿瘤组织中neu表达水平相比肿瘤早期接种使用的B16neu细胞大幅下降,提示肿瘤接种后可能发生了免疫逃逸。结论总结如下：1.慢病毒能高效感染小鼠骨髓来源的树突细胞且对其功能没有显著的影响；2.DCneu能有效预防和治疗Her2/neu过表达肿瘤。另外我们发现,小鼠骨髓来源树突细胞培养体系中通常被视为巨噬细胞等非树突细胞而丢弃的“无用”的贴壁细胞,实际上是合格的树突细胞。本研究的创新之处在于,首次（以目前发表的文献为准,下同）在同一小鼠树突细胞培养体系中对四种基因传递方法的效率进行了比较；首次证明离心转导和重复转导方案能大幅提高慢病毒对小鼠树突细胞的感染效率；首次利用慢病毒携带Her2/neu对小鼠树突细胞进行改造用于Her2/neu过表达肿瘤的免疫治疗研究；在类似的DCHer2/neu疫苗的临床前研究中首次采用了单次低剂量免疫注射并取得不亚于多次大剂量注射的效果；首次证明骨髓来源树突细胞培养体系中的贴壁细胞为合格的树突细胞。本研究为Her2/neu改造的树突细胞疫苗的临床应用提供了参考和依据。
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