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克罗恩病（Crohn’s Disease,CD）是一种主要表现为肠道大量CD4+T细胞和巨噬细胞浸润以及肠道屏障功能损伤的节段性非特异性炎症性疾病。其发病机制到目前为止仍不清楚,目前的观点认为其发病主要与基因、遗传、环境、肠道微生物和免疫功能异常等因素相关。近期的研究认为,克罗恩病主要是一种由黏膜固有层Th1型Th17细胞及其相关细胞因子介导的慢性肠道炎症。虽然TNF-α单抗的问世对CD的治疗是一项重大突破,但是约有1/3患者对TNF-α单抗无反应性,还有部分患者由于反复使用出现耐药。此外,反复使用TNF-α单抗会增加CD患者严重感染和淋巴瘤的发生率。总之,对于TNF-α单抗治疗无效或者不能使用者,需要寻求新的生物制剂来替代。然而目前临床上针对单个致炎因子的单抗（IFN γ和IL-17A的单抗）治疗效果不能令人满意,因此,针对T细胞亚型的单抗（而不是针对单个细胞因子）可能对IBD有更好的治疗作用。CD52是一种主要表达于成熟T淋巴细胞和B淋巴细胞表面的糖蛋白,其在在单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞表达很少。阿伦珠单抗（Campath-1H）,是一种人源化的 CD52 单克隆抗体（CD52 monoclonal antibody,CD52 mAb）,能通过CDC,ADCC和促凋亡等多种途径发挥免疫相关细胞杀伤作用,引起适应性免疫的持久性改变,特别是对CD4+T细胞有持久的抑制作用。目前阿伦珠单抗已临床应用于风湿性关节炎、淋巴细胞性白血病等疾病的治疗和器官移植。最近的Ⅲ期临床试验结果显示对复发缓解型多发性硬化也有较好的疗效。我们先前的研究发现,每周1次、连续2周使用20mg鼠源化的CD52mAb腹腔注射能够改善IL-10敲除小鼠的病理学评分,但具体的免疫学机制并不十分清楚。目前,IBD发病分子机制的研究主要通过转基因、基因敲除和化学药物诱导的小鼠模型进行。尽管小鼠模型不能够完全模仿人类疾病,IL-10基因敲除小鼠与人类CD有许多相似的特征。IL-10能够调控Th1和Th17细胞相关细胞因子的分泌,促进免疫平衡。在肠道内容物包括致病菌、毒素和抗原物质的刺激下,IL-10缺乏小鼠因机体的异常免疫反应在SPF环境下发生自发性结肠炎。因此,本课题使用目前成熟的IL-10基因敲除小鼠作为CD模型,观察不同时间点给予鼠源化的CD52单抗对CD4+T细胞的清除效果,根据CD4+T出现恢复性增长前的时间点观察鼠源化CD52单抗作用于靶器官造成的病理改变,相关炎性因子及调节因子水平的变化,外周血、免疫器官及肠道固有层CD4+T淋巴细胞的清除情况和迁移情况,CD4+T细胞的分化情况以及肠黏膜屏障功能的变化。旨在探讨应用鼠源化的CD52单抗对CD模型小鼠的治疗作用及其可能的相关机制,为今后在临床应用CD52单抗治疗CD提供理论依据。全文共分两个大部分,共三个研究:第一部分研究一 CD52单抗对CD模型小鼠黏膜CD4+T淋巴细胞的清除作用及其分化影响的机制目的:本研究观察鼠源化CD52单抗对CD模型小鼠黏膜CD4+T淋巴细胞的清除作用及其分化影响的机制。方法:16周龄SPF级C57BL/6 IL-10敲除（IL-10 KO）小鼠随机分为两组:IL-10 KO组和CD52单抗组（CD52mAb组）,而C57BL/6野生型小鼠为WT组,CD52mAb组给予腹腔注射20μg鼠源化的CD52单抗,给药后一周再次予以相同量的单抗进行强化治疗,IL-10 KO组及WT组给予相同量的IgG予以腹腔注射。末次给药后每周取一次外周血,连续6周,观察CD52mAb对CD4细胞的清除作用,得出恢复性增长时间点,观察CD4细胞出现明显恢复性增长前结肠CD4+T淋巴细胞的改变及其分化的趋势。结果:IL-10 KO小鼠给予CD52mAb治疗后能够保持连续4周的低淋巴细胞水平。与IL-10 KO组相比,CD52mAb治疗后4周小鼠外周血、脾脏和黏膜固有层的CD4+T细胞水平显著降低（P<0.05）。此外,黏膜固有层CD4+CD8a+T细胞,IL-17,IFN-γ和IL-12/23 p40水平也显著下降（P<0.05）。促进CD4+T细胞向Th1和Th17分化的pSTAT4、pSTAT3和IL-21水平在CD52mAb治疗后也显著下降（P<0.05）。结论:CD52mAb对CD模型小鼠的治疗机制与CD4+T淋巴细胞的清除、抑制CD4+T淋巴细胞向Th1和Th17的分化,减少黏膜炎症因子的产生相关。研究二 CD52单抗对CD模型小鼠肠道淋巴细胞迁移的影响目的:观察鼠源化CD52单抗对CD模型小鼠肠道淋巴细胞迁移的影响。方法:16周龄SPF级C57BL/6 IL-10敲除（IL-10 KO）小鼠随机分为两组:IL-10 KO组和CD52单抗组（CD52mAb组）,而C57BL/6野生型小鼠为WT组,CD52mAb组给予腹腔注射20μg鼠源化的CD52单抗,给药后一周再次予以相同量的单抗进行强化治疗,IL-10 KO组及WT组给予相同量的IgG予以腹腔注射。予以CD52mAb治疗后4周对结肠淋巴归巢的影响及其作用的相关机制。结果:与 IL-10 KO 组相比,CD52mAb 治疗后 4 周 ICAM-1、MAdCAM-1 和 TNF-α相对基因表达量显著下降（P<0.05）,产生TNF-α的黏膜固有层CD11b+F4/80+巨噬细胞比例也显著降低（P<0.05）,但黏膜固有层和脾脏F4/80+总的巨噬细胞比例以及脾脏CD11b+F4/80+巨噬细胞比例虽然有一定的下降,但未见明显统计学差异（P>0.05）。结论:CD52mAb对CD模型小鼠的作用机制与抑制淋巴细胞向结肠黏膜固有层的迁移密切相关;此外,抑制巨噬细胞向具有促炎作用的CD11b+F4/80+巨噬细胞分化也可能是CD52单抗治疗的重要机制。第二部分CD52单抗对CD模型小鼠结肠黏膜屏障功能的影响目的:观察鼠源化CD52单抗对CD模型小鼠结肠黏膜屏障功能的影响。方法:16周龄SPF级C57BL/6 IL-10敲除（IL-10 KO）小鼠随机分为两组:IL-10 KO组和CD52单抗组（CD52mAb组）,而C57BL/6野生型小鼠为WT组,CD52mAb组给予腹腔注射20μg鼠源化的CD52单抗,给药后一周再次予以相同量的单抗进行强化治疗,IL-10 KO组及WT组给予相同量的非特异性IgG予以腹腔注射。观察CD52单抗治疗4周后对CD模型小鼠结肠黏膜屏障功能的影响。结果:与IL-10 KO组相比,CD52mAb治疗显著改善IL-10 KO小鼠的结肠炎症状和肠道通透性（P<0.05）。CD52mAb治疗还能改善紧密连接蛋白（occludin和ZO-1）的表达和分布,并改善紧密连接的形态学。CD52 mAb治疗还能够有效抑制肠道上皮细胞凋亡、减少TNF-α和TNFR2的mRNA表达量、减少上皮的长链MLCK和磷酸化的MLC蛋白水平（P<0.05）。结论:CD52mAb治疗能够改善IL-10敲除小鼠肠黏膜屏障,其机制与抑制TNF-α/TNFR2调控的上皮细胞凋亡及改善MLCK依赖的紧密连接通透性相关。