论文部分内容阅读
目的:脓毒症是导致ICU患者死亡最常见的病因之一,病死率高达30%~50%。脓毒症常常累及肺脏,引起的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)可危及生命,控制炎症瀑布样反应是防治ARDS的重点。MicroRNAs(miRNAs)是多种病理生理过程中的重要调控因子,参与调节细胞周期、分化、凋亡和炎症反应等,近年来研究发现miRNAs在ARDS中发挥重要调节作用。MicroRNA-129-5p(miR-129-5p)是miR-129家族的一员,最近研究表明其有抑制炎症的作用,但在ARDS中尚无相关研究。本研究探讨miR-129-5p在LPS诱导的人肺微血管内皮细胞(HPMECs)损伤中的作用及其机制。方法:1.收集健康志愿者和临床脓毒症患者的血液标本,分离血清,使用RT-qPCR检测血清中miR-129-5p的水平。并收集患者的临床资料进行统计分析。2.以HPMECs作为研究对象,使用LPS刺激HPMECs细胞来模拟ARDS时肺血管内皮细胞的损伤效应。10μg/ml LPS分别刺激HPMEC细胞0h、6h、12h、24h和48h,收集细胞提取RNA,RT-qPCR检测细胞中miR-129-5p的表达水平。3.将细胞分为对照组(Control)和LPS组,LPS组予以10μg/ml的LPS处理,对照组加入等体积PBS,然后分别加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基进行培养。提取RNA检测miR-129-5p水平,用划痕实验和Transwell实验来评估细胞的迁移能力。4.通过Targetscan数据库分析发现,PIK3R1可能是miR-129-5p的靶基因之一,而PIK3R1是PI3K的调节亚基,可以激活PI3K/Akt通路。使用双荧光素酶报告验证miR-129-5p和PIK3R1是否存在结合位点。5.使用miR-129-5p模拟物(mimic)及阴性对照(negative control,NC)转染HPMECs。RT-qPCR检测miR-129-5p和PIK3R1 mRNA的表达,ELISA检测炎症因子的水平;同时提取细胞蛋白,用Western blot和免疫荧光检测PIK3R1蛋白水平的表达。通过Transwell和划痕实验分析细胞的迁移能力,RTCA实验分析细胞的增殖能力,流式细胞技术检测凋亡,并检测PI3K/Akt通路蛋白PI3K、Akt、p-Akt的表达情况。6.使用PIK3R1小干扰RNA(siRNA)和阴性对照(NC)转染HPMECs。RT-qPCR检测PIK3R1 mRNA的表达,Western blot检测PIK3R1蛋白以及PI3K/Akt信号通路蛋白PI3K、Akt、p-Akt的表达情况。Transwell和划痕实验评估细胞的迁移能力,RTCA实验用于检测细胞增殖。结果:1.受试者血清中miR-129-5p的表达和正常志愿者相比,脓毒症患者血清中miR-129-5p表达水平明显降低(P<0.05)。脓毒症合并ARDS患者血清中miR-129-5p的表达水平更低(P<0.05)。2.LPS刺激对HPMECs细胞迁移能力的影响LPS用来刺激HPMECs诱导细胞损伤,miR-129-5p的表达水平降低(P<0.05),且miR-129-5p在24 h时表达水平最低。划痕实验显示,LPS组划痕愈合率低于Control组(P<0.05);Transwell结果表明,和Control组相比,LPS组细胞迁移数目更少(P<0.05)。3.PIK3R1是miR-129-5p的靶基因双荧光素酶报告显示,miR-129-5p和PIK3R1存在着7个碱基对的结合位点。4.miR-129-5p mimic转染对HPMECs细胞的影响和miR NC组相比,miR-129-5p mimic组中,miR-129-5p表达升高(P<0.01),细胞划痕愈合率升高,细胞迁移数目增多,增殖能力变强,细胞凋亡减少。LPS处理之后,细胞中的IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α等炎症因子水平升高,转染miR-129-5p mimic能够降低炎症因子的表达水平。RT-qPCR结果表明LPS组PIK3R1 mRNA的表达上调,Western blot和免疫荧光结果表明:LPS组PIK3R1蛋白表达增加,PI3K、p-Akt蛋白表达减少。转染miR-129-5p mimic之后,PIK3R1 mRNA和蛋白水平较miR NC组下调,PI3K、p-Akt蛋白水平升高。5.干扰PIK3R1的表达对HPMECs的影响。和siRNA NC组相比,PIK3R1 siRNA组PIK3R1 mRNA水平显著降低(P<0.001),细胞迁移能力和增殖能力增强,PIK3R1蛋白表达降低,PI3K和p-Akt蛋白表达上调。结论:miR-129-5p在脓毒症患者血清和LPS处理的HPMECs细胞中表达降低,深入研究发现,miR-129-5p通过靶向PIK3R1基因调节PI3K/Akt通路,减轻LPS诱导的HPMECs细胞损伤和炎症反应。转染miR-129-5p模拟物能抑制LPS诱导的ARDS模型中炎症因子的产生,促进细胞迁移和增殖,减轻内皮细胞损伤。