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目的:临床上,核苷(酸)类似物(NAs)抗病毒治疗的最终目标是实现cccDNA的清除,定量检测HBV cccDNA是判断抗病毒疗效甚至是根治HBV感染的最理想指标。然而cccDNA的定量检测需要进行肝穿刺活检,这种有创检测存在风险与禁忌。因此,各大指南应用cccDNA的间接产物HBsAg作为替代指标。在本课题组长达十余年的慢乙肝患者NAs抗病毒治疗临床队列中,经过长期有效的NAs抗病毒治疗后,HBV DNA不可测获得完全病毒学应答至少3年以上的患者中,大约有80%的患者血清HBsAg水平逐渐下降。然而,我们同时也发现另外20%达标停药的患者血清HBsAg水平在下降到一定水平后就基本不再下降,甚至维持在高水平,但也未发现HBV DNA反弹。由此可见,这部分患者并没有遵循HBsAg水平与HBV DNA、cccDNA含量相互平行的规律。我们由此推测HBsAg除了主要由cccDNA转录表达外,还可能存在不依赖cccDNA表达的旁路。若HBsAg确实存在不依赖cccDNA的表达旁路,那么HBsAg作为反映cccDNA转录活性的唯一指标即具有局限性。因此,本研究的主要目的是为了建立可模拟HBV S基因不依赖cccDNA独立表达通路的体外模型,以验证HBV S基因不依赖cccDNA表达HBsAg旁路的存在。方法:本研究从慢乙肝HBV DNA阳性患者的血清中提取总DNA,以此为模板,利用HBV S基因特异性引物,扩增出HBV S基因。将HBV S基因片段与质粒载体pc DNA3.1-GFP连接,构建含HBV S基因的表达载体质粒pc DNA3.1-S-GFP。将重组质粒分别转染未感染HBV的Huh7和HepG2细胞系。观察转染后HBsAg的表达情况。结果:(1)HBV S基因利用特异性引物扩增提取成功。(2)重组含HBV S基因表达载体质粒pcDNA3.1-S-GFP构建成功。(3)重组表达载体质粒pcDNA3.1-S-GFP转染HepG2、Huh7细胞成功。(4)转染后细胞培养上清液检测结果:采用Elisa法测得空白组、对照组中HBsAg表达均为0,实验组中HBsAg表达均为阳性;采用罗氏法定量测得:空白组、对照组中HBsAg检测量均为0。实验组中,转染前HBsAg检测量均为0。在Huh7细胞系中,转染后48h HBsAg检测值为0.535±0.137IU/ml,72h后为0.495±0.144IU/ml,96h后为0.457±0.172IU/ml;在HepG2细胞系中,转染后48h HBsAg检测值为0.488±0.137IU/ml,72h后为0.453±0.134IU/ml,96h后为0.429±0.126IU/ml;(5)转染96h内,转染时长对HBsAg表达影响无统计学意义(P>0.05);转染细胞系对HBsAg表达影响无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)含HBV S基因的质粒pcDNA3.1-S-GFP转染HepG2/Huh7肝癌细胞系构建的体外模型验证了HBV S基因不依赖cccDNA表达HBsAg旁路的存在;(2)HBsAg作为反映cccDNA转录活性的唯一指标具有局限性。