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目的：肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，尤其在亚洲和非洲发病率极高。仅在我国每年新发病例数就超过50万，年死亡率约20万例次。由于本病早期诊断不易，缺乏有效治疗手段，肝癌一旦临床确诊，预后极差。所以，加强对肝细胞癌的病因、发病机理和早期预防研究显得极为迫切。目前国内外学者认为肝细胞癌与乙型或丙型肝炎病毒感染、黄曲酶毒素、饮水污染、酗酒等因素有关。尤其是慢性乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)感染与肝细胞癌的发生有着密切联系。有资料显示，乙型肝炎病毒表面抗原(HepatitisBvirussurfaceantigen，HBsAg)携带者患肝细胞癌的危险性比HBsAg阴性者高217倍。而在肝细胞癌患者中，乙型肝炎病毒感染率达到60％～90％。在肝癌细胞中发现乙型肝炎病毒基因的整合也支持HBV感染是HCC的重要病因。HBV感染致HCC的确切机制尚未彻底阐明，乙肝病毒DNA的整合、HBVX基因编码产物反式激活作用、癌基因激活或抑癌基因失活、感染肝细胞免疫损伤及再生肝细胞累积基因突变等是目前公认的HCC几大发病机制。在以上过程中，多数伴有乙肝病毒基因组变异。由于HBV复制过程中容易发生碱基错配，而DNA聚合酶缺乏校正功能，常常发生基因突变。乙型肝炎病毒基因组某些位点变异可影响HBV的生物学性状、甚至影响其致病性，而且与乙型肝炎病毒感染者的临床进程和预后密切相关。已有学者对肝癌患者体内HBV基因序列研究发现存在较多变异，如在HCC中整合的HBVDNA中前S2/S区3端有截断，其序列编码产物第79个氨基酸残基以下的202个氨基酸残基缺失，该产物具有反式激活功能，可以激活人c-myc癌基因；前S删除突变可导致HBsAg在内质网积聚，引起内质网应激和肝细胞氧化性DNA损伤、突变，从而诱导HCC发生。又如在肝癌患者中存在高比例的核心启动子区1762A→T和1764G→A错义突变；还有学者发现编码HBx第87，88，116，118，119，127和144位氨基酸编码区变异在肝癌患者中相当频繁。此外，在肝细胞癌中也发现前C/C基因区变异，但与其它慢性肝病比较无差异性，提示该区变异与HCC发生可能没有直接关联。P基因区是HBV基因组中最大的开放读码框，与多个基因相重叠，该区的变异发生也较高，但该区变异一般影响病毒的复制及前基因组RNA的包装，与肝癌发生的关系不大。可见乙型肝炎病毒X基因及前S/S基因变异与肝癌发生的关系更为密切。但HBV基因变异与肝癌发生之间是否存在相关还有待证实。为了找出与肝癌发病相关的特征性变异位点，以便为以后HBV相关肝癌防治研究提供理论依据，我们使用高保真DNA聚合酶，对肝癌伴HBV感染患者及其家族中HBsAg阳性者血清乙型肝炎病毒X和前S/S基因片段作聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)扩增，分别将PCR产物克隆并测序。根据S基因区编码氨基酸的差异，确定每株HBV基因型和血清型。通过BLAST检索及与GeneBankHBV标准序列对比分析，找出HBV相关肝癌患者与非肝癌HBsAg阳性者体内乙型肝炎病毒基因变异差别。然后对两组资料进行统计学处理。
方法：实验分组：肝癌组9例，均为HBsAg阳性并经病理检查证实的HCC患者；对照组11例，为肝癌组患者家族中HBsAg阳性者。HBsAg检测使用酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)测定。留置血清标本，酚氯仿法提取血清HBVDNA，根据GeneBank中HBV中国株的相应保守序列设计引物。PCR扩增乙型肝炎病毒X基因及前S/S基因片断，利用胶回收方法纯化相应目的基因片段，回收产物经加A反应处理后分别与pBS-T载体连接并转化大肠杆菌Top10感受态细胞，在含氨苄青霉素、IPTG、X-gal的LB固体琼脂平板上过夜培养。通过蓝白斑筛选阳性克隆。细菌增殖后抽提质粒作限制性核酸内切酶切开，检测切下条带大小是否与目的基因一致，以初步判定重组质粒有无相应基因片段，再将重组质粒PCR扩增相应目的基因片段鉴定。将带有目的基因片断的重组质粒测序。测序引物为T3或T7通用测序引物。分别将各序列结果登陆GeneBank并与标准HBV株对比，作基因分型及血清型鉴定。然后将各序列分别与相同基因型的标准株序列作BLAST检索对比，列出每株变异位点。同一变异位点超过2株视为活跃变异位点。最后，将两组资料比较，作统计学处理，找出肝癌患者体内乙型肝炎病毒基因变异特点，得出结论。
结果：除B2样本未能扩增出HBV前S/S基因，仅扩增出S基因外，其余19个样本均扩增出HBVX和前S/S基因。所有HBV株均属于C或B基因型，其血清型均为adrq+或adw2。肝癌患者来源的HBV在HBx蛋白和表面抗原的B/T细胞表位、HBx蛋白的反式激活区、核心启动子区(Basalcorepromoter,BCP)发生的变异率较高。HBVX基因区发生错义突变致编码HBx蛋白氨基酸变异有：26R→C，30V→F，33P→S，36P/A→T，38P→S，这些氨基酸位于HBx蛋白的B细胞表位；103位T→M，116V→L，118T→K，119E→D，这些氨基酸位于HBx蛋白的Th细胞表位。在HBx反式激活区，发现密码子127V→I、129F→L变异。BCP区以1752G→A、1760T→A变异多见，但这些位点变异与对照组相比没有统计学意义。前S/S基因变异见于前S1区84、94位氨基酸变异；前S2起始密码子变异致M蛋白不能表达；前S2区2、6、22位氨基酸发生变异；S区变异见于HBsAg抗体结合域内129位氨基酸H→Q变异，这些位点变异与对照组相比也没有统计学意义(P＞0.05)。值得注意的是，前S区删除变异在肝癌组中比例达到44.44％(4/9)，与对照组(0/10)相比有统计学意义(P＜0.05)。
结论：中国HBV相关性肝细胞癌患者感染的乙型肝炎病毒主要为B或C基因型，这与乙型肝炎病毒不同基因型的地理分布一致。在肝癌组中，两型所占比例无显著差异。HBVX和前S/S基因某些位点突变在肝癌组中比例较高，变异位点多在包膜蛋白和HBx蛋白的抗体结合域或T/B细胞表位，以及X基因的反式激活区和核心启动子区，但这些位点变异与肝癌发生并无密切相关。前S基因删除变异致L蛋白中段截短可能与肝细胞癌的发生密切相关。