【摘 要】
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Csu-mi R260转基因水稻具有很好的抗虫效果和产业化发展的潜力,但是Csu-mi R260-16和Csu-mi R260-18两个株系插入序列的分子特征不清楚,且具有萌发率下降的表型。本研究以Csu-mi R260转基因水稻的Csu-mi R260-16和Csu-mi R260-18两个独立株系为研究材料,分析了其外源基因插入位点侧翼序列特征,基因组变异特征,mi RNA以及前体表达特征和不
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Csu-mi R260转基因水稻具有很好的抗虫效果和产业化发展的潜力,但是Csu-mi R260-16和Csu-mi R260-18两个株系插入序列的分子特征不清楚,且具有萌发率下降的表型。本研究以Csu-mi R260转基因水稻的Csu-mi R260-16和Csu-mi R260-18两个独立株系为研究材料,分析了其外源基因插入位点侧翼序列特征,基因组变异特征,mi RNA以及前体表达特征和不同激素处理下的种子萌发特征,为该转基因产品的安全评价提供数据支撑,也为抗虫RNAi转基因作物的安全评价提供理论依据和参考。获得的主要研究结果如下:1.采用TAIL-PCR技术和基因组重测序同时对Csu-mi R260-16和Csu-mi R260-18两个株系的T-DNA插入位点进行了鉴定,发现Csu-mi R260-16的插入位点的左侧和右侧分别为位于1号染色体的11863348和11863480,替换了基因组133 bp,转入的T-DNA序列左边界缺失27 bp,右边界缺失54 bp。Csu-mi R260-18的插入位点的左侧和右侧分别为位于4号染色体的31311317和31311395,替换了基因组78 bp,转入的T-DNA序列左边界缺失170 bp,右边界缺失24 bp。2.通过基因组重测序分析野生型中花11、Csu-mi R260-16和Csu-mi R260-18转基因水稻的基因组变异特征,以日本晴基因组为参考,发现中花11、Csu-mi R260-16和18的SNPs分别为194172个,193030个和193289个;In Dels分别为41218个,40610个和40551个;SVs分别为6401个,6287个和6241个;CNVs分别为4868个,4794个和3852个。其次发现中花11,Csu-mi R260-16和18的SNPs,In Dels均在6号染色体中部和11号染色体末端有较高密度的分布。使用中花11与3000份水稻重测序数据库过滤差异的SNPs,In Dels后,发现Csu-mi R260-16和18中特有的SNPs和In Dels分别为17688和10763个,共有的SNPs和In Dels分别为9742和6036个。Csu-mi R260-16和18中过滤后的SNPs和In Dels变异均在11号染色体末端有较高密度的分布。3.采用TaqMan探针实时荧光定量PCR（TaqMan RT-q PCR）和茎环实时荧光定量PCR（Stem-Loop RT-q PCR）分别对Csu-mi R260-16和Csu-mi R260-18两个转基因水稻中Csu-mi R260插入序列的表达情况和剪切后的ami R260s进行了定量检测。发现Csu-mi R260插入序列和剪切形成的20 nt和21 nt两个成熟ami R260s在Csu-mi R260转基因水稻苗期的根、茎、叶中表达且无组织表达特异性。4.通过种子萌发试验发现中花11,Csu-mi R260-16和Csu-mi R260-18的萌发率分别是95%,60%和40%。采用1μM ABA对中花11,Csu-mi R260-16和18进行萌发处理,发现中花11,Csu-mi R260-16和18萌发率均降低;在10μM ABA处理下,萌发率更低。采用1μM和5μM GA分别对中花11,Csu-mi R260-16和18进行萌发处理,发现1μM和5μM GA对Csu-mi R260-16的萌发具有显著促进作用,对Csmi R260-18不显著。采用1μM和5μM ABA抑制剂分别对中花11,Csu-mi R260-16和18进行萌发处理,发现1μM和5μM ABA抑制剂对Csu-mi R260-16和18的萌发均有促进作用。5.根据Csu-mi R260-16和Csu-mi R260-18转基因水稻插入位点两侧基因特征和差异表达结果,构建侧翼序列中差异表达的两个基因LEA9和STPK的CRISPR/Cas9敲除转基因水稻材料,并获得具有编辑效果的转基因水稻株系。
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