前言　　由关节炎和创伤等原因造成的软骨缺损及功能障碍是临床上面临的难题之一[1]。利用软骨组织工程的方法再造软骨治疗软骨损伤，在临床上具有良好的应用前景[2]。临床中，如何能尽快地形成新的骨组织至关重要，不仅可以缩短骨折愈合的时间，也为尽快地恢复骨的功能打下了坚实的基础。因此，要首先了解软骨细胞形成的相关机制，以及影响软骨细胞形成的相关因子和信号通路。　　骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是一类具有潜在多分化能力的成体干细胞，可以在体内及体外诱导分化为成骨细胞和软骨细胞等不同类型细胞[3,4]。此外，BMSCs具有极强的自我修复能力，获取简单、增殖力强、来源广泛、免疫原性弱[5]、自体移植不发生排斥反应[6]、不涉及伦理等特点，成为组织细胞工程研究的热点。　　Wnt蛋白是一类高度保守的分泌型糖蛋白，其作为信号因子参与了包括生长、发育和凋亡在内的众多进程[7]。Wnt通过作用于细胞膜上的受体，进一步激活细胞内的信号转导系统，从而调节相关靶基因的表达。研究发现Wnt信号通路受体LRP5发生功能缺失突变后会造成骨质疏松的表型，表明Wnt信号通路在骨形成过程中起重要作用[8]。有研究表明，在小鼠肢体发育及软骨分化过程中检测到了多种Wnt基因的表达[9]。Wnt3a可以促进人间充质干细胞增殖并抑制其分化为成骨细胞及软骨细胞[10,11]。Wnt5a调控软骨细胞的形成，Wnt5b抑制软骨细胞的分化[12，13]。在间质凝结(mesenchymalcondensations)中过表达Wnt1，Wnt7a或者Wnt14会抑制其分化为软骨细胞[14-16]。上述研究表明Wnt信号通路可能在调控间充质干细胞分化方面起重要作用。最近有报道发现Wnt11可以在软骨细胞中诱导Ⅱ型胶原蛋白(typeⅡcollagen)的表达[17]。Ⅱ型胶原蛋白表达量的增加是间充质干细胞向软骨细胞分化的标志事件之一，这表明Wnt11可能在调控间充质干细胞向软骨细胞分化过程中起重要作用。此外，Xu等人的研究发现在三维藻朊酸盐凝胶上诱导人间充质干细胞向软骨细胞分化的过程中Wnt11基因在诱导分化的中后期阶段高表达[18]。　　生长因子在BMSCs定向分化为软骨细胞的过程中起到了非常关键的作用，已有学者研究得出，TGF-β1能够诱导BMSCs向软骨细胞分化[19,20]。TGF-β1在诱导BMSCs转化为软骨细胞的过程中，对软骨细胞的分化和功能具有双向调节作用，可以促进未分化或分化早期的软骨细胞DNA合成、增殖、分化及细胞外基质的合成，抑制成熟软骨细胞的增殖和分化。这种双向调节作用与TGF-β1的浓度密切相关，有研究表明[21,22]，不同浓度的TGF-β1可能通过影响BMP-2，进而影响BMSCs向软骨细胞的分化，浓度过低，不足以引发BMP-2的表达，不能诱导软骨的形成，浓度过高，则导致BMSCs向软骨细胞分化的潜能下降，不利于诱导分化。　　JNK通路是MAPK通路家族的三大主要成员之一，目前已发现三种，分别由三个基因编码，JNK1、JNK2、JNK3。该途径的特点之一是可被多种应激因素激活，，也可被多种类型的细胞表面受体激活。相对于ERK途径，就目前的研究，对JNK途径在MSCs分化中的作用及其在软骨细胞增殖和分化过程中的作用还不是十分明确。有学者经研究得出IL-17通过JNK途径诱导MMP13和aggrecanase的表达从而引起关节软骨细胞基质的降解[23]。　　蛋白激酶C(PKC)属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，广泛分布于机体各器官、组织和细胞中，是肌醇磷脂信号通路的中心环节。DelCarol[24]等研究认为激活PKCβ1通路，结果导致软骨细胞死亡，若添加特异性PKCβ1抑制剂，可完全抑制软骨细胞死亡。Ciarmatori[25]等研究认为，PKC信号通路与多种信号通路一起参与了诱导软骨细胞的增殖和早期分化过程。以上的研究表明，PKC作为重要的信号因子，参与调解软骨细胞生长、增殖、分化等多种生物学效应，但尚缺乏具体机制。　　本研究拟采用大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象，通过慢病毒介导的转基因技术，将Wnt11转染入骨髓间充质干细胞，结合体外诱导软骨形成等实验，在TGF-β1存在的条件下，加入或不加入JNK和PKC抑制剂，探讨TGF-β1在骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的协同作用。　　材料和方法　　一、实验材料　　1、主要试剂　　DMEM培养基（Gibco，美国）　　PBS（Hyclone，美国）　　FBS（Hyclone，美国）　　胰酶（Hyclone，美国）　　HISTOPAQUE-1083（Sigma，美国）　　MTT（Sigma，美国）　　DMSO（Sigma，美国）　　细胞周期检测试剂盒（Hyclone，美国）　　Polybrene（Sigma，美国）　　引物（生工，中国）　　PCR试剂盒（Hyclone，美国）　　多聚甲醛（Hyclone，美国）　　Cy3标记山羊抗兔（Hyclone，美国）　　tritonX100（Hyclone，美国）　　山羊血清（Hyclone，美国）　　DAPI（Sigma，美国）　　Wnt11（Santa，美国）　　COL2A1（Santa，美国）　　Wnt11抗体（Santa，美国）　　Ⅱ型胶原多克隆抗体（Santa，美国）　　Aggrecan抗体（Santa，美国）　　BCA蛋白浓度测定试剂盒（Hyclone，美国）　　预染蛋白分子量标准（Fermentas，加拿大）　　TGF-β1（Hyclone，美国）　　JNK抑制剂（Hyclone，美国）　　PKC抑制剂（Hyclone，美国）　　成软骨诱导液（Hyclone，美国）　　阿尔新蓝（Hyclone，美国）　　2、主要仪器　　倒置相差显微镜（OLYMPUS，日本）　　CO2培养箱（力申，中国）　　超净工作台（安泰，中国）　　流式细胞仪（BD，美国）　　酶标仪（BIOTEK，美国）　　紫外分光光度计（Thermo，美国）　　荧光定量PCR仪（Thermo，美国）　　激光共聚焦扫描显微镜（OLYMPUS，日本）　　双垂直蛋白电泳仪（BD，美国）　　凝胶成像系统（Thermo，美国）　　二、实验方法　　1、SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定　　采用密度梯度离心法从大鼠后臀的胫骨和股骨骨髓腔中分离出骨髓间充质干细胞，采用流式细胞术对分离的骨髓间充质干细胞表面的CD34，CD45，CD44和CD29等进行鉴定。　　2、构建Wnt11慢病毒表达载体，转染骨髓间充质干细胞　　细胞分为Wnt11+eGFP基因转染组，慢病毒空载体转染组，未转染对照组，以荧光显微镜检测转染效率及细胞生长情况。　　3、检测细胞的Wnt11表达水平　　在2中的三组细胞中加入Wnt11抗体，分别以免疫荧光法、实时定量PCR法和westernblot法检测2中细胞的Wnt11表达水平。　　4、检测细胞的增殖情况　　利用MTT法检测2中的三组细胞的增殖情况。　　5、检测Aggrecan和CollagenⅡ的表达水平　　在2中的三组骨髓间充质干细胞中加入软骨细胞标志基因Aggrecan和CollagenⅡ抗体，分别以实时定量PCR法和westernblot法检测Aggrecan和CollagenⅡ的表达水平，再利用免疫组化检测上述三组细胞中CollagenⅡ的表达情况。　　6、TGF-β1对体外诱导软骨形成实验的研究　　将2中的三组细胞分别在加入或不加入TGF-β1情况下进行体外诱导软骨形成实验，进行阿尔新蓝染色，并测定OD590处的吸光值;利用实时定量PCR检测Aggrecan，CollagenⅡ及软骨形成调控基因Sox9，RUNX2和Ihh的表达水平。　　7、抑制剂对体外诱导软骨形成实验的研究　　TGF-β1存在的情况下，在培养基中分别加入JNK抑制剂SP600125和PKC抑制剂GF109203X，进行体外诱导软骨形成实验。实时定量PCR检测三组骨髓间充质干细胞分化形成的软骨细胞中Aggrecan和CollagenⅡ表达量的变化情况。　　结果　　1、SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定　　流式细胞仪检测得出CD34、CD45、CD44、CD29的阳性表达率分别为3.25％、4.25％、95.73％、93.71％，证实所分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。　　2、Wnt11慢病毒表达载体转染BMSC后细胞生长良好，转染效率提高　　Wnt11慢病毒表达载体转染的BMSC中，荧光显微镜下观察得出细胞生长良好，转染效率提高。　　3、Wnt11慢病毒表达载体转染BMSC后，Wnt11表达上调　　Wnt11慢病毒表达载体转染的BMSC中，免疫荧光法、实时定量PCR法和westernblot法检测得出Wnt11的表达上调，明显高于慢病毒空载体转染组和未转染对照组。　　4、Wnt11慢病毒表达载体转染BMSC后抑制细胞的增殖　　三组细胞均在第四天增殖能力达到峰值，Wnt11+eGFP基因转染组的BMSC的OD值小于其他两组，说明通过Wnt11慢病毒转染抑制了BMSC的增殖。　　5、Wnt11慢病毒表达载体转染BMSC后，Aggrecan和CollagenⅡ表达水平上调　　在加入软骨细胞标志基因Aggrecan和CollagenⅡ抗体后，实时定量PCR法和westernblot法检测得出，基因转染组BMSC的Aggrecan和CollagenⅡ表达水平上调，其他两组无明显差异。另外，免疫组化检测得出基因转染组BMSC的CollagenⅡ呈阳性表达，细胞质呈棕黄色，其他两组无明显变化。　　6、TGF-β1可以促进BMSC体外诱导软骨形成　　三组BMSC在加入TGF-β1的情况下，经阿尔新蓝染色得出，OD590的值要明显高于未加入TGF-β1的BMSC。Real-timePCR检测得出，加入TGF-β1的情况下，Aggrecan、CollagenⅡ及软骨形成调控基因Sox9，、RUNX2和Ihh的表达上调，明显高于未加入TGF-β1的BMSC。　　7、JNK和PKC抑制剂可以抑制BMSC体外诱导软骨形成　　在TGF-β1存在的情况下，经Real-timePCR检测得出，加入JNK抑制剂SP600125和PKC抑制剂GF109203X的BMSC，Aggrecan、CollagenⅡ的表达下调，明显低于未加入抑制剂组BMSC。　　结论　　1、BMSC经Wnt11慢病毒载体转染后，抑制BMSC的增殖，Aggrecan和CollagenⅡ的表达水平上调，可以进行后续实验研究。　　2、在经Wnt11慢病毒载体转染后的BMSC中加入TGF-β1，可以使软骨标志性基因Aggrecan、CollagenⅡ及软骨形成调控基因Sox9，、RUNX2和Ihh的表达上调，促进BMSC体外诱导软骨形成。　　3、经Wnt11慢病毒载体转染后的BMSC，在TGF-β1存在的条件下，加入JNK抑制剂和PKC抑制剂可以使Aggrecan、CollagenⅡ的表达下调，抑制BMSC体外诱导软骨形成。