该研究源自国家自然科学基金项目(81273871)背景：颈动脉粥样硬化斑块是由于脂肪、血栓、结缔组织和碳酸钙在颈动脉沉积所造成的一种对人体有害的状态,是一种多种危险因素所致的进行性动脉血管疾病病理表现,常会因局部缺血而引发脑梗死等严重后果。随着生活水平的提高,高脂血症、高血压、糖尿病、吸烟、肥胖与日俱增,尤其以中老年居多,而这些都是目前认为引发动脉粥样硬化疾病的重要危险因素。与此同时,中老年患者也是颈部疾患的高发人群,常见的包括颈椎病、颈椎间盘突出症、颈椎关节紊乱等。鉴于手法治疗对缓解颈部疼痛或不适的显著疗效,以及患者对口服药物的副作用的顾虑,该人群患者往往会将颈椎旋转手法等物理治疗方式作为首选。据统计,在美国每年约有8百万人因颈部疼痛求医,而其中1百万人会选择推拿治疗,但接踵而至的,一方面是对手法疗效的认可,另一方面却是关于手法治疗不当造成颈部疾患不良事件报道。相关数据显示,1995年美国因颈部推拿造成脑血管损伤的事故占全部推拿事故的6.2%。这些层出不穷的不良事件(包括缺血性脑卒中、脑梗死等)以及其高致死率不可避免的引起了相关领域专家和临床医生的高度重视,颈部推拿手法对颈动脉粥样硬化疾病患者的影响也随之成为学科界专家关注的焦点之一。颈动脉粥样硬化颈动脉斑块所致官腔狭窄、血流动力学改变及斑块脱落形成栓子是引起脑缺血的主要机制。其中,大部分缺血性脑卒中及脑梗死的患者与颈动脉粥样斑块稳定性密切相关。动脉斑块按病理变化可分为两类：稳定性斑块和不稳定型斑块,后者较前者更易脱落,形成血栓,引发脑血管疾病的风险更高,故颈部手法对不稳定性动脉粥样硬化斑块的影响也无疑成为当前相关领域的研究热点。然而,颈动脉粥样硬化是一个进行性的疾病,随着病情的进展及各种因素的刺激,稳定性斑块有可能向不稳定性动脉斑块发展。那么,颈部手法是否会是刺激稳定性斑块向不稳定性斑块发展的重要因素是本研究要解释的关键问题。目的：本研究主要包括两个方面：1、通过测量颈部旋转手法和推桥弓法作用后的颈动脉斑块的破裂压力值与对照组的相比较,以研究颈部推拿手法是否会造成斑块物理结构改变,使其稳定性降低；2、通过对比三组(普通饲料喂养组、颈椎旋转手法组、高脂饲料喂养B组)实验兔的颈动脉硬化斑块的微区拉曼光谱,以研究稳定性动脉斑块的拉曼光谱特点以及颈部推拿手法是否会改变斑块脂质成分而影响动脉斑块的稳定性。方法：1、兔稳定性动脉粥样硬化斑块模型建立及分组：选购普通级健康纯种雄性成年新西兰兔40只,以普通饲料喂养15天后,将实验兔分为两大组,其中随机选取10只作为普通饲料喂养组,继续以普通饲料喂养至18周。剩余30只作为高脂饲料喂养A组,改用高脂肪饲料喂养至14周。14周后,再将高脂饲料喂养A组的30只实验兔随机分为3个小组,分别是：颈椎旋转手法组、推桥弓组和高脂肪饲料喂养B组,并继续以高脂饲料喂养至18周。最后,纳入手法干预及结果分析的实验兔被分为四个小组：普通饲料喂养组、颈椎旋转手法组、推桥弓组和高脂肪饲料喂养B组。2、兔稳定性动脉粥样硬化斑块模型评估第一、兔血脂代谢的检测分别于6周、10周、14周每次从高脂饲料喂养A组的实验兔中随机选取8只兔进行血液生化检验。于抽血前1天下午,给待抽血的家兔禁食,次日清晨(空腹大于12h)从兔耳缘静脉采集血液2.5mL。将其注入含有抗凝剂的普通试管中,静置1h后,将试管置于离心机中进行离心10min,速度为1500r/min。抽取上层血清,送至南方医院检验科,全自动生化仪测定血清中三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL),高密度脂蛋白(HDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)含量。第二、病理学观察分别于6周、10周、14周从高脂饲料喂养A组的实验兔中随机选取1只处死,取颈动脉全长,纵行切开,将其置于4%的甲醛溶液中固定,逐级脱水,透明,石蜡包埋,连续切片,HE染色,观察病理变化。第三、统计学方法采用SPSS 13.0软件对实验兔的一般情况及血脂生化检验所得数据进行统计分析。两组数据均以均数±标准差表示。两组数据采用两独立样本t检验。以P<0.05为显著性差异。3、手法干预于14周时分别对颈椎旋转手法组和推桥弓组的实验兔进行相应的手法干预。颈椎旋转手法组将兔子颈部左右各旋转1次(手法以将兔子颈部旋转至极限即止),1次/3天,共15天,共5次；推桥弓组沿着左右颈动脉各推20次,1次/天,共15天,共15次。4、颈部推拿手法对兔颈动脉粥样硬化斑块体外稳定性分析第一、分析装置1个压力记录装置(SMC PRESSURE,ZSE30-01-65M),1个150ml注射器,1个三通管,3根压力传输管,1根7号针头,1对9V电池和1对电池夹。利用三通管和压力传输管分别将注射器、压力记录装置、7号针头连接起来。电池夹与压力记录装置电源线相连,正负极分别与电池正负极相连。通过注射器逐步加压,将压力通过压力传输通道末端的针头传递到斑块内,通过压力记录装置记录斑块破裂时出现的最大压力值。第二、兔颈动脉粥样硬化斑块体外稳定性分析分别在三组颈动脉中取肉眼观察向管腔内突起明显的新鲜斑块各8处,与血管外膜与管壁成大约30°方向进针,根据进针时的阻力变化和肉眼观察,判断针头是否进入斑块部位内膜下,在确定针尖进入斑块内膜后,以15ml/s匀速推动注射器以加压,记录斑块破裂时的压力值。第三、统计学方法各组数据均以均数±标准差表示。多组均数间比较采用单因素方差分析,均数间两两比较采用LSD-t检验。采用SPSS13.0软件对所得数据进行统计分析。以双侧α=0.05为显著性差异。5、颈椎旋转手法对颈动脉粥样硬化区拉曼光谱特征的影响第一、样本处理实验结束时处死动物,游离颈动脉,纵行切开,再将动脉放入PBS(pH7.4)溶液中,于-80℃冰箱保存,以备拉曼光谱测定。第二、拉曼光谱检测检测前解冻标本,于取出的两组动脉(颈椎旋转手法组和高脂饲料喂养B组)中各选出6处具有较明显的斑块的动脉,普通饲料喂养组随机选6条,生理盐水洗净,以633nm的激发作为激发光源,激光器输出功率：10.4mw,光斑直径：1μm；各物质光谱的拉曼位移范围旋转为1100～1900cm-1,信号被收集并校正,信号收集时间为15～60s。第三、特征峰相对强度统计学分析采用以零点为基数,运用Origin6.0软件算出每个特征峰(1450cm-1及1660cm-1处)信号的相对强度。计量资料运用SPSS13.0统计软件对颈椎旋转手法和高脂饲料喂养B组的拉曼光谱进行统计学分析处理,数据以χ±S表示,两两之间的比较采用T检验。以P<0.05具有统计学意义。结果：1、实验动物死亡数量纳入雄性成年新西兰兔40只,喂养过程中死亡10只。其中,高脂饲料喂养A组中的30只实验兔中死亡5只。普通饲料喂养组的10只实验兔死亡5只。实验造模过程中,总存活率66.7%。最终纳入分组进行实验分析的兔总计30只。2、颈动脉粥样硬化兔血脂水平变化6周、10周、14周时,高脂饲料喂养A组30只实验兔血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)水平呈逐步升高,高密度脂蛋白(HDL)水平呈逐步降低,各项指标两组间差异无统计学意义(P>0.05)。3、病理观察结果第6周,颈动脉病理切片示：内膜完整而光滑,中膜平滑肌走行清晰,无增生；第10周,颈动脉病理切片示：动脉内皮受损增生,凸向管腔,有泡沫细胞形成；第14周,颈动脉病理切片示：可见明显泡沫细胞聚集,管腔可见明显红色血栓生成,符合动脉粥样硬化早期稳定性动脉斑块病变特点。4、破裂压力检测结果在压力作用下斑块发生破裂,肉眼可见加压时斑块部位发生凸起,持续加压至一定值时凸起消失,同时压力表所示压力值降低,记录斑块破裂瞬间所示的最大压力值。颈椎旋转手法组、推桥弓组和高脂饲料喂养B组之间均无显著性差异(P>0.05)。5、旋转手法组与高脂饲料喂养B组的拉曼光谱检测第一、旋转手法组与对照组的拉曼光谱检测普通饲料喂养组的拉曼光谱图中,1450cm-1和1660cm-1处未见明显脂质特征峰；颈椎旋转手法组的拉曼光谱图中,1450cm-1和1660cm-1处可见明显脂质特征峰；高脂饲料喂养B组的拉曼光谱图中,1450cm-1和1660cm-1处可见明显脂质特征峰。第二、特征峰相对强度测量的结果读取颈椎旋转手法组与高脂饲料喂养B组的谱线,将拉曼峰值和对应的波长(相对强度)用SPSS13.0软件进行T验,两组标本在1450,1660nm-1脂质特征峰处的相对强度差异无统计学意义(P>0.05)结论：1、在颈动脉粥样硬化病变早期,颈椎旋转手法与推桥弓法短期内不会影响稳定性斑块的物理结构。2、在颈动脉粥样硬化病变早期,颈椎旋转手法短期内不会增加稳定性斑块的脂质成分。