柑橘绿霉病拮抗乳酸菌的筛选及苯乳酸对Penicillium digitatum的抑菌活性研究

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柑橘类水果是世界范围内很多国家主要的消费果品,也是我国重庆特色水果之一。由于柑橘果实水分含量高且营养物质丰富,在采后贮藏运输过程与货架期中易受病原菌侵染而引起腐烂。由指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病是柑橘果实采后最严重的侵染性病害。由于化学杀菌剂的长期使用,造成了公众对杀菌剂的残留、病原菌耐药性的发展以及化学杀菌剂对人类健康和环境安全的潜在危害的持续关注。因此,人们渴望找到对人体安全、对环境无害的防腐保鲜方式和物质来替代或减少化学杀菌剂的使用。生物防治剂替代化学杀菌剂应用于果蔬采后保鲜显示出较大潜力。其中,乳酸菌已广泛应用于在食品保鲜中,其具备拮抗效果较好,不产生毒素,公认安全的食品级微生物(GRAS)等优点,有可能替代化学杀菌剂。苯乳酸作为乳酸菌具有抑菌活性的主要天然代谢产物,对食品中的多种腐败真菌及细菌具有良好的抑制作用。近年来,人们越来越重视鉴定具有抑菌活性的新型乳酸菌菌株,以作为生物拮抗剂应用于食品中,但利用乳酸菌及其抑菌活性代谢产物苯乳酸控制柑橘果实采后病害的研究还较少。本试验挑选泡菜和腊肉为最初分菌对象,离体条件下探究分离得到的乳酸菌对柑橘果实病原真菌P.digitatum的抑菌效果,筛选出具备拮抗能力的乳酸菌并鉴定。以柑橘果实为试材,探究离体条件下筛选出的13株拮抗乳酸菌对柑橘果实采后绿霉病的防治效果,最终选出了两株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum):L.plantarum CKXP13和L.plantarum CWXP24。进一步探究L.plantarum CKXP13和L.plantarum CWXP24无菌发酵液的抑菌特性,测定其分泌的苯乳酸产量,并进一步考察了苯乳酸对柑橘果实病原菌P.digitatum的抑制效果及作用机理。主要研究结果如下:(1)从川渝地区采集的泡菜与腊肉样品中共分离得到菌株224株,离体条件下初步筛选出13株对柑橘果实病原菌P.digitatum具备拮抗能力的乳酸菌,菌株鉴定结果为:植物乳杆菌Lactobacillus plantarum(5株),类谷糠乳杆菌Lactobacillus parafarraginis(3株),干酪乳杆菌Lactobacillus casei(2株),副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei(1株),布氏乳杆菌Lactobacillus buchneri(1株),类肠膜魏斯氏菌Weissella paramesenteroides(1株)。(2)进一步开展13株拮抗乳酸菌抑菌活性研究,结果表明13株乳酸菌的细胞悬浮液和无菌发酵液均能够抑制P.digitatum的生长,不同菌株间的抑菌效果存在差异;柑橘果实同孔损伤接种试验表明,L.plantarum CKXP13和L.plantarum CWXP24的细胞悬浮液与无菌发酵液对柑橘果实病原菌P.digitatum引起的绿霉病都有较强的控制效果。(3)培养时间与培养基初始p H变化对L.plantarum CKXP13和L.plantarum CWXP24无菌发酵液的抑菌活性均有较大影响,培养基初始p H=6、培养时间不短于42 h为保持无菌发酵液对P.digitatum抑菌活性的最佳培养条件;L.plantarum CKXP13和L.plantarum CWXP24无菌发酵液经过氧化氢酶、蛋白酶处理后,抑菌活性下降,证明两株植物乳杆菌产生的抗真菌活性物质包括过氧化氢及蛋白类物质;p H中和处理试验结果表明,两株植物乳杆菌产生的主要抗真菌活性物质包括有机酸。(4)测定了L.plantarum CKXP13和L.plantarum CWXP24的产酸能力,结果表明两株植物乳杆菌均有较强的产酸能力,且有机酸产量变化与两株菌的生长趋势一致,随着培养时间的增加,有机酸产物不断积累,p H不断下降至4左右;利用高效液相色谱测定两株植物乳杆菌无菌发酵液中苯乳酸的产量,结果表明L.plantarum CKXP13和L.plantarum CWXP24在培养中均代谢产生苯乳酸,产量分别为42.4 mg/L和91.9 mg/L。(5)测定苯乳酸对柑橘果实病原菌P.digitatum的生长抑制情况,确定了苯乳酸对P.digitatum的最小抑菌浓度,对孢子的致死作用及对菌丝生长的抑制作用。试验结果表明,苯乳酸能显著抑制病原菌P.digitatum的生长,最小抑菌浓度为2.5 mg/m L,对孢子的存活有强烈抑制作用,并且对菌丝生长也有较强抑制作用。(6)利用扫描电镜观察苯乳酸处理后病原菌P.digitatum的菌丝表面形态,结果表明苯乳酸处理能导致病原菌P.digitatum的菌丝表面出现明显褶皱凸起,菌丝整体分布更加不规则,出现相互缠绕、扭曲,表面形态发生较严重的变化。此外,苯乳酸处理能够破坏病原菌P.digitatum菌丝体的细胞膜结构,从而导致其通透性改变,使胞外电导率显著增大,且苯乳酸浓度越高胞外电导率数值越大。柑橘果实同孔损伤接种试验表明,苯乳酸对柑橘果实病原菌P.digitatum引起的绿霉病具有控制效果。
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