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单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌,是一种能够引起人畜共患病的食源性致病菌,属李斯特菌属。食用了被单增李斯特污染的食物后可以引起“李氏杆菌病”,死亡率可达20%～30%。该菌主要侵袭孕妇、新生儿、老年人和免疫力低的人群。近年来由该菌引起的食物中毒事件越来越多,引起了人们的广泛关注。传统的检测单增李斯特菌的方法操作繁琐、检测时间较长,通常需要5～7d才能完成,并且灵敏度较低。因此建立快速、灵敏的检测食物中单增李斯特菌的方法对于控制单增李斯特菌引起的食物中毒具有重要意义。针对单增李斯特菌(CMCC54001)GenBank中(基因号Af253320’1)hlyA保守序列,运用在线引物设计软件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)设计LAMP引物。对镁离子浓度、dNTPs浓度、反应时间等扩增条件进行优化,确定25μL的LAMP反应体系为:内引物(FIP和BIP)各1.2 mmol/L,外引物(F3和B3)各0.2 mmol/L,环引物(LB)0.6 mmol/L,1.6 mmol/L dNTPs,5 mmol/L MgSO4,10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液,8 U的Bst DNA聚合酶大片段,2μL DNA模板,并用灭菌双蒸水补足体系。LAMP的反应过程为:先在65℃水浴锅中反应20 min,然后在80℃水浴锅中水浴10 min终止反应。反应结束后,通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀即可判断LAMP反应是否发生,亦可通过琼脂糖凝胶电泳证实反应是否发生。过夜培养的单增李斯特菌菌液用生理盐水进行10倍梯度稀释后,取各稀释度菌液1 mL用化学试剂法提取细菌DNA,并以此作为模板,进行LAMP和PCR敏感性试验。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌纯培养的灵敏度为2.4 CFU/mL,而对照PCR检测单增李斯特菌纯培养的灵敏度为240 CFU/mL。过夜培养的单增李斯特菌菌液用猪肉匀浆液进行10倍梯度稀释后,取各稀释度菌液1 mL用化学试剂法提取细菌DNA,并以此作为模板,进行LAMP和PCR检测人工污染检出限试验。结果表明,LAMP检测猪肉中单增李斯特菌的检出限为68 CFU/g,从样品处理到报告结果,耗时2 h,对照PCR检测猪肉中单增李斯特菌的检出限为6800 CFU/g,从样品处理到报告结果,耗时4 h。利用LAMP方法对4株单增李斯特菌菌株,5株李斯特属的非单增菌株和13株其它肠杆菌致病菌进行特异性试验。结果表明,4株单增李斯特菌为阳性,其他18株菌株为阴性。初步研究了4种从人工污染单增李斯特菌的猪肉中提取模板DNA的方法,结果表明,LAMP对制备模板DNA方法的要求不高。研究表明,LAMP技术灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单,为快速检测食品中单增李斯特菌构建了一个技术平台。