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大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)在自然界广泛存在。随着畜禽集约化养殖模式的不断发展,畜禽感染E.coli O157:H7非常普遍,这给畜禽养殖业带来了较大的经济损失。大肠杆菌多宿主、多途径传播等一些特点,导致E.coli O157:H7感染已成为一个全球性的公共卫生问题。脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)作为机体血液循环中含量最丰富的类固醇物质,因其独特的生物学功能而被认为是具有多向性的“激素缓冲剂”。目前,对DHEA生物学功能的研究主要集中于其对机体代谢、中枢神经系统、氧化应激等方面,有关DHEA对细菌感染的动物免疫机能的影响及其相关机制方面的研究报道甚少。因而,本试验选用小鼠作为研究对象,在探讨DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠免疫功能的调节作用之上,通过体外阐明DHEA对E.coli O157:H7感染的原代腹腔巨噬细胞炎症反应的缓解效应及其机制;研究旨在揭示DHEA对小鼠抵抗细菌感染、缓解炎症的确切作用及相关通路间的“对话”关系。研究结果将为揭示DHEA对机体免疫功能的影响提供重要的理论依据,同时对保障畜禽和人类健康具有一定的指导性意义。1 DHEA对小鼠抵抗E.coli O157:H7感染的研究本实验以ICR小鼠为研究对象,在建立E.coli O157:H7感染小鼠模型基础之上,探讨DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠存活情况、免疫指数、组织病理学变化等方面的影响,以期揭示DHEA对小鼠抗E.coli O157:H7感染能力的影响。小鼠腹腔注射E.coli O157:H7探讨小鼠对E.coli O157:H7的耐受性,以便确定E.coli O157:H7对小鼠的半数致死量。小鼠灌胃3周不同浓度的DHEA后腹腔注射LD50的E.coli O157:H7,一周后采集血清、脾脏、小肠等组织,待测。利用稀释涂布平板法测定小鼠腹腔液细菌浓度;HE染色观察小鼠小肠组织病理学变化;试剂盒检测乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶活性。结果表明,E.coli O157:H7对小鼠的LD50为2.3×108CFU。LD50的E.coli O157:H7感染导致小鼠小肠组织出现肠绒毛断裂、脱落、出血等病理学变化,而DHEA处理能够降低E.coli O157:H7感染所致的损伤、提高小鼠成活率,并呈现出明显的剂量依赖性。此外,2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理可显著提高小鼠脾脏免疫指数、脾脏中乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶活性,并显著降低小鼠腹腔液细菌浓度(P<0.05)。以上结果提示,DHEA处理可调节脾脏免疫功能、清除感染细菌,提高小鼠的成活率。2 DHEA对小鼠抵抗E.coli O157:H7感染作用的机制研究本试验以E.coli O157:H7感染的小鼠为研究对象,探讨DHEA对炎症介质和细胞因子产生的影响及其可能的信号转导机制,旨在揭示DHEA抵抗E.coli O157:H7感染生物化学机制。小鼠灌胃DHEA并用LD50的E.coli O157:H7感染,试验结束后采样、待测。试剂盒检测脾脏和血清中iNOS活性和NO含量;Real-time PCR法检测脾脏细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-4和IL-10 mRNA表达水平;酶联免疫吸附法测定脾脏和血清中IFN-γ和IL-4含量;Western blot法检测脾脏MAPK和NF-κB蛋白表达水平。结果表明,0.2 mg/kg DHEA处理可显著降低血清中iNOS活性(P<0.05),2 mg/kg DHEA处理可显著降低血清中NO含量(P<0.05)。2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理均可显著降低脾脏中iNOS活性(P<0.01)以及TNF-α、IL-1β和IFN-γmRNA表达水平(P<0.05);4 mg/kg DHEA处理可显著降低脾脏IL-6mRNA表达水平(P<0.05)。2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理可显著升高脾脏IL-4 mRNA表达水平(P<0.05),4 mg/kg DHEA处理可显著升高脾脏IL-10 mRNA表达水平(P<0.05)。2 mg/kg DHEA处理可极显著降低脾脏IFN-γ含量(P<0.01),而2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理可显著升高血清IL-4含量(P<0.05)。此外,2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理均可显著降低脾脏中p-p38 MAPK蛋白表达水平(P<0.05),而对p-ERK1/2和p-JNK1/2蛋白水平没有显著性影响(P>0.05);2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理均可极显著降低p-IκB-α和细胞核内NF-κB蛋白水平,升高胞质中IκB-α和NF-κB蛋白水平(P<0.01)。以上结果提示,DHEA可降低炎性介质和促炎因子的表达、促进抗炎因子的表达而缓解E.coli O157:H7诱发的炎性反应,且这种效应可能是通过抑制p38 MAPK和NF-κB的表达而实现的。3 DHEA调节小鼠原代腹腔巨噬细胞抗E.coli O157:H7感染的作用及其机制研究本试验以ICR小鼠原代腹腔巨噬细胞为研究对象,探讨DHEA对E.coli O157:H7引起的炎症反应的调节作用及其信号转导机制。试验首先分析E coli O157:H7对小鼠原代腹腔巨噬细胞损伤的时间效应,以确定DHEA的处理浓度和E.coli O157:H7作用时间。稀释涂布平板法检测小鼠原代腹腔巨噬细胞的吞噬能力;酶联免疫吸附法测定细胞培养液中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 含量;Western blot 法分析 iNOS、COX-2、p38 MAPK和NF-κB蛋白表达水平。结果表明,100 μmol·L-1的DHEA显著降低小鼠原代腹腔巨噬细胞活力(P<0.05)。E.coli O157:H7感染细胞3 h时产生显著性损伤,且一定浓度的DHEA预处理可显著缓解E.coli O157:H7诱发的损伤(P<0.05);但当E.coli O157:H7感染细胞4 h时产生DHEA处理无法缓解的严重损伤。不同浓度的DHEA处理对细胞的吞噬能力没有显著影响(P>0.05)。0.1μmol·L-1 DHEA处理极显著降低细胞培养液中TNF-α和IL-1β的含量(P<0.01),而0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1 DHEA均能显著降低细胞培养液中IL-6的含量(P<0.05)。0.1μmol·L-1和10 μmol·L-1 DHEA处理均能显著降低细胞iNOS和COX-2蛋白水平(P<0.05)。0.1 μmol·L-1和10 μmol·L-1 DHEA具有与SB203580(p38 MAPK特异性抑制剂)相似的生物学作用,其均可显著降低p-p38 MAPK蛋白水平、显著升高IκB-α蛋白水平(P<0.05);0.1μmol·L-1-10 μmol·L-1 DHEA均能显著降低p-IκB-α和细胞核中NF-κB蛋白水平,并显著抑制细胞质中NF-κB的减少(P<0.05)。以上结果提示,DHEA通过下调p38 MAPK和NF-κB活化而降低E.coli O157:H7诱导的小鼠原代腹腔巨噬细胞炎性因子的过度产生,最终表现为缓解炎症的发展。结果提示,DHEA可提高E.coli O157:H7感染小鼠脾指数、降低腹腔菌体浓度、减轻小肠组织的病理损伤,整体上表现为提高E.coli O157:H7感染小鼠的成活率。DHEA可降低iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性介质的过度产生,同时促进抗炎因子IL-4和IL-10的分泌,从而缓解E.coli O157:H7感染导致的炎症损伤。DHEA通过抑制p38 MAPK蛋白活化而阻断NF-κB的活化入核,进而调节炎性因子的表达以缓解过度的炎症反应,最终实现对E.coli O157:H7感染小鼠的保护效应。