论文部分内容阅读
目的:创伤、炎症、肿瘤等各种原因导致的牙槽骨损伤,持续发展会导致患者牙脱落缺失,植牙困难,进而引起口腔功能障碍,还会有美观和心理困扰,因此修复损伤的牙槽骨对提高人们生活质量意义重大。本研究发现不同生长因子在牙周膜干细胞(Human Periodontal Ligament Stem Cells,hPDLSCs)成骨分化的过程中具有时空特异性,即碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)促进其增殖和成血管分化,转化生长因子β3(Transforming Growth Factor-β3,TGFβ3)促进其成骨分化,为此设计了一种次序释放bFGF和TGFβ3的自愈合水凝胶,原位注射于牙槽骨缺损部位,通过序贯释放不同生长因子来修复损伤的牙槽骨,为牙周组织工程领域的基础研究提供一种新的解决方案和修复手段。方法:(1)以原代hPDLSCs增殖和成骨分化性能对bFGF和TGFβ3两种生长因子进行评价和剂量筛选,涉及到的实验方法有:组织块-酶消化细胞提取术,流式细胞术,碱性磷酸酶染色法,结晶紫染色法。(2)利用Schiff-base反应,制备以壳聚糖为基质的复合TGFβ3微球和bFGF自愈合水凝胶,其中TGFβ3壳聚糖微球采用乳化交联法制备。自愈合水凝胶由改性壳聚糖(Chitosan glutamate,CSG),四臂聚乙二醇苯甲醛(4-Arm-Polyethylene Glycol-Benzaldehyde,PEG-BA),bFGF和TGFβ3微球组成。通过胶凝时间、流变性能、溶胀性能、内部结构、体外降解等指标进行配方筛选和优化。酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定水凝胶中bFGF和TGFβ3的体外释放量。(3)自愈合水凝胶体外药效学研究:分别进行了管腔形成实验、细胞迁移实验、成骨分化实验、细胞毒性实验和细胞3D培养实验。(4)自愈合水凝胶体内药效学研究:采用SD大鼠牙槽骨缺损模型进行研究,微计算机断层扫描技术(Micro computed tomography,Micro-CT)验证造模成功后,在给药后1 w,6 w观察牙槽骨的修复情况。大鼠皮下埋植实验研究其体内相容性及体内降解过程。结果:(1)MTT法测定hPDLSCs增殖结果表明bFGF促进了hPDLSCs的增殖(P<0.01,vs Control),而TGFβ3不影响hPDLSCs正常生长。成骨分化实验发现bFGF抑制了hPDLSCs的骨向分化,而TGFβ3促进其骨向分化(诱导14 d,P<0.01,vs Control)。同时,bFGF促进HUVEC形成管腔(最佳剂量为80 ng/m L);TGFβ3可加速hPDLSCs在Transwell小室内的迁移(最佳剂量为250 ng/m L)。(2)微球中TGFβ3的载药量可达到23.53±0.41μg/mg。CSG溶液(分别为1%,2%,3%)与20%PEG-BA的体积比为1:0.05时,水凝胶胶凝时间小于2 min,胶凝时间不随PEG-BA(20%)体积增加而缩短。1%CSG水凝胶孔径大小不一,微球分布不均匀,PBS溶液中快速降解;2%和3%CSG的水凝胶孔径大小相同,微球分布均匀,但3%CSG的水凝胶降解较慢,溶胀率较高,优选CSG浓度为2%。优选配方为:2%CSG溶液与20%PEG-BA的体积比为1:0.05,微球的用量为5 mg/m L。初步的体外释放研究发现,自愈合水凝胶在前期快速释放bFGF,7d后释放量达到80%左右,而TGFβ3的释放在1d后才被检测,且7d后释放量只有40%左右。(3)HUVEC能在自愈合水凝胶上形成完整的管腔样结构;hPDLSCs在TGFβ3诱导下发生迁移,并向骨向分化。细胞3D培养显示细胞能在自愈合水凝胶内存活并生长。(4)成功建立SD大鼠牙槽骨缺损模型,给药1周后,Micro-CT扫描结果显示,与模型组和空白凝胶组相比,低剂量组(TGFβ3,1μg/m L;bFGF,100 ng/m L)和高剂量组(TGFβ3,4μg/m L;bFGF,100 ng/m L)牙槽骨缺损部位都有不同程度的牙槽骨再生;给药处理6 w后,高剂量组缺损部位面积明显少于其它组。皮下埋植42d后,2%CSG自愈合水凝胶降解了80%。结论:(1)bFGF和TGFβ3在hPDLSCs成骨分化的过程中发挥了不同的作用:bFGF促进hPDLSCs的增殖,在快速增殖阶段发挥作用,同时促进微小血管生成,为hPDLSCs提供营养支持;TGFβ3在分化阶段发挥作用,可促进hPDLSCs成骨分化。(2)优选自愈合水凝胶配方为:2%CSG溶液与20%PEG-BA的体积比为1:0.05,微球的用量为5 mg/m L。此自愈合水凝胶具有较为理想的理化特性,载双因子的凝胶体外可以序贯释放bFGF和TGFβ3。(3)载药自愈合水凝胶体外可以诱导血管形成,模拟细胞微环境募集hPDLSCs并促进骨形成。(4)载药自愈合水凝胶对牙槽骨缺损模型大鼠可以有效地促进缺损牙槽骨的修复,是一种治疗牙槽骨损伤的新策略。