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目的:1.探讨糖尿病大鼠创面伴铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)感染,PA的T3SS分泌的毒力因子ExoU、ExoS、ExoT、ExoY对创面面积、菌落计数及组织形态学的影响,从而了解对创面愈合的作用。2.诱导自噬以及抑制自噬对糖尿病大鼠创面伴PA感染的创面面积、菌落计数及组织形态学的影响,从而了解对创面愈合情况的作用。方法:168只SD大鼠随机分为糖尿病组及非糖尿病组:两部分再随机分为3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)组,雷帕霉素(Rapamycin)组和未予自噬干预处理组,每组均感染6种菌株及1个未感染细菌小组。总的分组情况如下:糖尿病予3-MA处理感染PA01(DM+3-MA+PA01)组、糖尿病予3-MA处理感染PA14组(DM+3-MA+PA14)、糖尿病予3-MA处理感染PA01ΔexoTΔexoY组(DM+3-MA+PA01ΔexoTΔexoY/ExoS)、糖尿病予3-MA处理感染PA14ΔexoUΔexoT组(DM+3-MA+PA14ΔexoUΔexoT/ExoY)、糖尿病予3-MA处理感染PA14ΔexoUΔexoY组(DM+3-MA+PA14ΔexoUΔexoY/ExoT)、糖尿病予3-MA处理感染PA14ΔexoTΔexoY组(DM+3-MA+PA14ΔexoTΔexoY/ExoU),糖尿病予3-MA处理未感染组(DM+3-MA+未感染)。予雷帕霉素预处理及未予自噬干预处理的大鼠分为类似的7组。非糖尿病组分组同上。每小组各4只。分别在感染后第0、3、7、14、21天创面拍照计算创面面积,了解创面状况;取创面组织计算创面组织菌落数、组织形态学观察,其中第0天考虑尚未形成感染模型,不进行创面组织菌落计数。仅取第3天部分样本进行透射电镜观察。结果:1.基本情况:3-MA处理组大鼠观察终点较基线值血糖升高,体重为三组中最重,雷帕霉素处理组血糖及体重较基线值均下降。2.菌株对创面愈合的影响:1)创面:糖尿病组:感染第3、7天,ExoU及ExoS组创面状况较其余两组明显差,可见明显坏死、黑痂,ExoU组可见脓性渗出物,第14天各组创面明显缩小,坏死、渗出等明显改善,至第21天,创面均呈干燥状态,ExoU组创面面积大于其余三组,但未体现出统计学差异。ExoT及ExoY组创面状况较好,第3天也可见渗出、轻微坏死征象,第7天开始创面状况较前逐渐好转,至第21天创面趋于愈合。野生型菌株较基因敲除菌株在各个时点创面状况差,野生型PA01组和PA14组在第3天可见创面发黑,湿性渗出物多,第7天可见脓性分泌物,PA14组第21天创面还可见湿性分泌物,颜色鲜红。非糖尿病组与之呈现相似的规律,但各时点创面状况均较之稍好。ExoS、ExoT及ExoY组在观察终点完全愈合。2)菌落:糖尿病组:感染后第3天及第21天,DM+ExoU组创面菌落计数高于其余三组;感染后第7天,菌落数由高到低为:[ExoU(53421.67±7035.31)vs ExoS(628.23±98.23)vs ExoT(5.31±0.76)vs ExoY(1.92±0.30)CFU×10~6/g]。感染后第14天,四组间差异均有统计学意义,菌落数由高到低为:[ExoU(4506±854.05)vs ExoS(30.31±6.31)vs ExoY(0.56±0.12)vs ExoT(0.17±0.06)CFU×10~6/g]。随时间进展,DM+ExoU及DM+ExoS两组,菌落数先增加后下降,在第7天达到峰值;ExoT及ExoY组菌落数随时间进展,均呈逐渐下降趋势。感染后第14天及第21天,菌落计数均有DM+PA01/PA14>DM+ExoS/ExoU(P=0.003/0.007),菌落数均先增加,至第7天达峰值,然后下降,DM+ExoS组较DM+PA01组下降幅度大。在各个时点DM+PA14组创面菌落数均高于DM+ExoU组。DM+PA14组创面组织菌落数各个时点均高于感染PA01组。非糖尿病组:在感染后第14、21天均有ExoU组创面菌落数高于ExoS、ExoT及ExoY组,三组创面菌落数走势及数量基本一致。在各个时点均有野生型PA菌落数高于ExoS、ExoU组,PA14组高于PA01组。3)病理形态:糖尿病组:第0天各组间未见差异,至感染后第7天炎性细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)浸润逐渐增加,淋巴细胞等呈密集状态,且过程中始终保持ExoU与ExoS组炎性细胞密集程度高于ExoY与ExoT组。ExoU组在第7天内皮细胞及新生血管增加,成纤维细胞增加,考虑肉芽组织形成增多,ExoS、ExoT、ExoY组在第3天即出现此现象;ExoU、ExoS组至第21天炎性细胞浸润明显减少,成纤维细胞较多,创面处于增生愈合期。ExoT、ExoY组第21天可见排列正常的肌纤维。DM+PA14组至感染后第14天炎性细胞浸润逐渐增加达到峰值,DM+PA01组在感染后第7天炎性细胞浸润达到峰值,成纤维细胞数量较DM+PA14组为多,至感染后第21天,DM+PA01组较DM+PA14组肌纤维排列更为规则。在各个时点,野生型PA炎性细胞浸润较ExoU、ExoS组均更显著,成纤维细胞数量较少,炎性细胞浸润峰值出现早。非糖尿病组与之呈现相似规律,但炎性细胞浸润较糖尿病组减低。3.干预自噬对创面愈合的影响:1)创面:DM+ExoT、DM+ExoU、DM+ExoY、DM+PA01、DM+PA14、N+ExoS、N+ExoY、N+ExoT、N+PA01组诱导自噬后创面面积变大,且创面状况较未予自噬干预组变差,DM+Rapamycin+PA01组第3天创面可见坏死样物质,颜色暗沉,感染后第7、14天创面可见黑痂,未予自噬干预组创面坏死、黑痂程度轻。DM+Rapamycin+PA14组第14天、21天仍可见创面坏死样物质,创缘不整,创面湿性分泌物明显,创面面积仍较大。未予自噬干预组与之比较创面较干燥,面积小,肉芽组织长势好。抑制自噬后创面状况较未予自噬干预组或诱导自噬组变好,面积表现出变小的差异。2)菌落:DM+ExoY、DM+ExoU、DM+ExoT、DM+PA01、DM+PA14、N+PA01、N+ExoS、N+ExoU等组别均为应用雷帕霉素诱导自噬后菌落计数均高于未予自噬干预组。N+ExoT组应用3-MA抑制自噬后菌落计数低于未予自噬干预组,此外,DM+ExoS、DM+ExoT、DM+ExoU、DM+ExoY、DM+PA01、DM+PA14、N+ExoS、N+PA01组均为应用3-MA抑制自噬后菌落计数低于诱导自噬组。3)病理:在感染第0天,各组未见明显异常,均可见规则皮肤组织,肌纤维排列规则,可见脂肪细胞及少量炎性细胞,予3-MA处理组淋巴细胞稍多;感染后第3天,予雷帕霉素处理组可见大量炎性细胞募集,及血管破裂等可能造成的红细胞外泄集中,感染后第7天成纤维细胞数量明显少于其余两组;至第21天3-MA处理组组织形态趋于正常组织,鲜有炎性细胞。4.DM+PA01ΔexoTΔexoY组感染后第3天创面组织电镜下可见自噬小体,在×2k共8个视野中可见4个自噬小体。结论:1.分泌ExoU的PA菌株较分泌ExoS的PA菌株更不利于糖尿病大鼠感染创面的愈合,ExoT、ExoY毒力较弱,但能增强ExoU、ExoS对创面愈合的不利影响。2.诱导自噬不利于糖尿病大鼠感染创面的愈合,抑制自噬可促进愈合。