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[目的] 单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒(HSV1+2/VZV)是皮肤和黏膜感染的主要病原体，这两种病毒的感染可以呈现非典型的临床表现，症状相似，在临床上很难鉴别，需要实验室方法帮助鉴别诊断。The Lyra Direct HSV1+2/VZV检测方法是一种新的三重实时PCR方法，能够用于临床皮肤和黏膜标本HSV1+2/VZV的检测。本文主要验证The Lyra Direct HSV1+2/VZV检测方法检测肿瘤患者皮肤或/和黏膜感染HSV1+2和VZV的临床意义。 [方法] 1.标本采集与处理 连续收集695份美国纽约Memorial Sloan-Kettering Cancer Center医院有皮肤黏膜病变临床表现的肿瘤患者的标本，在695份标本中有57份标本来源于生殖器和肛周，剩余638份标本采集于患者皮肤黏膜。其中有340份取自男性患者(48.9％)，355份来自于女性患者(51.1％)，患者平均年龄和年龄的标准差是52.8±19.6岁。标本运输使用Remel公司含有M4RT介质的微生物运输管运送到实验室，先用于HSV和VZV培养，而后把剩余标本分装好，贮存于-80℃冰箱。 2.细胞培养 细胞培养是把250μl含有M4RT介质的样本加入到有含有MRC-5细胞培养的试管或A549细胞的壳瓶，在37℃孵育2-14天。试管细胞培养法通过每天观察试管检测细胞病变效应确定有无HSV或VZV感染。壳瓶细胞培养是在孵育24小时和48小时后通过荧光标记的单克隆抗体结合HSV、VZV显影，用奥林巴斯BX-40荧光显微镜观察有无显影确认HSV和/或VZV感染。 3.The Lyra Direct HSV1-2/VZV检测方法 The Lyra Direct HSV1-2/VZV检测方法是利用多重实时聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)即使用多对引物和探针在同一个PCR反应体系中同时检测和鉴别待测样本中HSV-1，HSV-2和VZV的DNA以及过程质控(process control，PRC)的实时PCR。The Lyra Direct HSV1-2/VZV检测方法使用的仪器和试剂是美国生命技术公司(Life Technologies，Foster City，CA)的QuantStudio Dx实时荧光PCR仪和美国Quidel公司(Quidel Corp.，San Diego，CA)提供的仅用于临床研究的The LyraTM Direct HSV1+2/VZV检测试剂盒。此方法程序是:取100μl含有M4RT的样本于60℃孵育5分钟。而后加入25μl的过程缓冲液，接着转移5μl混合液到96孔反应板的孔中。在已加入的混合液的孔中再加入15μl的充分水化的扩增预混液(master mix)。接着密封反应板，把密封后的板放置于QuantStudio Dx实时荧光PCR仪中利用引物和探针扩增和检测HSV-1、HSV2和VZV。 4.实验室开发的检测方法(Laboratory-developed tests，LDT) 经The Lyra方法和细胞培养检测后结果不一致的样本用CepheidHSVanalyte-specific reagent(ASR)(Sunnyvale，CA)检测和分型HSV或者用ArgeneVZV R-gene ASR(bioMérieux，Durham，NC)检测VZV。检测HSV时，把5μl加热后的样本加到20μl CepheidHSV master mix中。而检测VZV时，把10μl加热后的样本加到15μl VZV master mix中。密封离心管，用SmartCyclerⅡ instrument(Cepheid)进行扩增。利用克隆和测序确定所有的阳性扩增产物。 [结果] 1.试管/壳瓶培养检测方法在695份标本中检测到99例HSV-1/2阳性(14.2％)和76例VZV阳性(10.9％)。 2.Lyra检测方法在695份标本中检测到117例HSV-1/2阳性(16.9％)和91例VZV阳性(13.1％)，并有一例结果无效，其结果无效率为0.14％。93份随机样本在不同天检测3次，有92份样本结果一致，其总符合率为98.9％。其中一例标本在前2次检测中显示阴性结果，但在第3次检测后显示为VZV阳性结果。Lyra检测方法的批内精密度为HSV-1:0.50-0.90％; HSV-2:0.41-1.0％; VZV:0.29-0.75％。批间精密度分别是HSV-1:2.33％; HSV-2:2.36％; VZV:2.61％。和细胞培养相比较，Lyra检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为:HSV-1/2:95.0％，96.1％，80.3％，和99.1％和VZV:93.4％，96.8％，78.0％，和99.2％。 3.细胞培养和Lyra检测方法有53个标本检测结果不一致，这些不一致的结果用两种独立的LDT实时PCR检测方法再次检测。在53个不一致的结果中，有10个标本为细胞培养阳性(5份HSV和5份VZV)而Lyra检测结果为阴性;其余43份标本为Lyra检测结果阳性(23份HSV和20份VZV)而细胞培养结果阴性。在10份细胞培养阳性而Lyra检测结果为阴性的标本中，其中有9份标本经两种独立的LDT PCR方法检测为阴性(4份HSV和5份VZV)。在43份Lyra检测结果阳性而细胞培养结果阴性的标本中，只有一份标本（20份VZV阳性标本中的一份）的结果经Lyra检测和LDT方法检测结果一致。相对的是，23份Lyra检测结果呈HSV阳性的样本，经LDT PCR检测后有19份标本结果为HSV阳性(82.6％)。细胞培养、Lyra检测方法和LDT PCR检测方法中，以≥2种以上方法检测结果一致作为结果判定的标准。Lyra检测方法相对于上述标准比较后，其灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为:HSV-1，98.6％，99.7％，97.1％，和99.8％; HSV-2,100％,99.7％,95.7％，和100％; VZV,100％,96.9％,79.1％，和100％。 [结论] The Lyra Direct HSV1+2/VZV检测方法具有精密度高、重复性好、敏感性强，能够同时检测和鉴别皮肤和粘膜病变标本中HSV-1/2和VZV。此方法不需要核酸提取步骤，可以1小时内在一个PCR反应体系中同时检测和鉴别出3种病毒，在临床应用中能够大幅度节省标本出报告的周转时间，同时减少检测人员的劳动强度。