碳源的吸收和利用是病原菌在寄主成功定殖和扩展的基础之一。当寄主葡萄糖的含量较低时，病原菌可以利用糖异生途径合成葡萄糖用于代谢，而糖异生途径的底物大多是四碳二羧酸。四碳二羧酸是三羧酸循环（TCA循环）的中间产物，是重要的碳源和能源物质。四碳二羧酸在真菌细胞内的利用离不开四碳二羧酸转运载体（C4-dicarboxylate transporter）的作用。但目前有关四碳二羧酸转运载体的研究主要集中在细菌中，在致病真菌中尚无该基因的研究和报道。探究昆虫病原真菌四碳二羧酸转运蛋白的功能，对于研究真菌的生长及定殖具有十分重要的意义。本研究通过同源重组的方法，构建了蝗绿僵菌（Metarhizium acridum）四碳二羧酸转运蛋白的敲除及回复菌株，解析四碳二羧酸转运蛋白MaDCT基因的功能。获得的实验结果如下：
　　1.MaDCT的生物信息学分析
　　根据已测序的蝗绿僵菌基因组获取MaDCT1和MaDCT2序列，设计引物，克隆得到MaDCT1和MaDCT2基因，序列比对以及系统进化分析表明MaDCT1和MaDCT2编码的氨基酸序列同源性较低。其中MaDCT1登录号为XP_007807917，编码458个氨基酸，等电点为6.71，蛋白质分子量为50.36kDa。MaDCT2（登录号XP_007818602）编码365个氨基酸，等电点为7.63，蛋白质分子质量40.17kDa，在MaDCT2基因组内有2个内含子。
　　2.MaDCT敲除和回复菌株构建
　　为了探究MaDCT1和MaDCT2在蝗绿僵菌中的功能，构建了MaDCT1和MaDCT2基因的敲除载体，并在此基础上构建了回复载体。通过农杆菌介导转化至蝗绿僵菌，经过PCR检测及Southern杂交验证，获得敲除菌株ΔMaDCT1，ΔMaDCT2，ΔΔMaDCT和相应回复突变菌株。
　　3.MaDCT对蝗绿僵菌生长和产孢的影响
　　观察敲除菌株以及野生型菌株的萌发率、产孢模式及产孢量。实验结果表明：ΔMaDCT1和ΔΔMaDCT中，蝗绿僵菌的孢子萌发提前，而MaDCT2基因的缺失对此并无影响；在营养丰富的1/4SDAY培养基上，ΔMaDCT1中，产孢时间延迟且隔间距变长，ΔMaDCT2中，产孢时间提前，ΔΔMaDCT中产孢时间延迟；但在营养相对缺乏的微循环产孢培养基SYA上，ΔMaDCT1及ΔΔMaDCT产孢由微循环产孢转换为正常产孢，MaDCT2基因的缺失并无明显影响。此外，只有MaDCT1基因的缺失使蝗绿僵菌在两种产孢模式的产孢量都显著降低。
　　4.MaDCT对蝗绿僵菌逆境敏感性的影响
　　对各敲除菌株进行了抗湿热、抗紫外能力以及抗胁迫能力的测定。实验结果表明：缺失MaDCT1基因使蝗绿僵菌对紫外线的耐受能力增强，对高渗胁迫剂山梨醇SOR抗性增强，对细胞壁破坏剂荧光增白剂CFW抗性减弱；缺失MaDCT2基因对蝗绿僵菌的逆境敏感性并无影响；ΔΔMaDCT菌株表型与ΔMaDCT1表型类似。通过对紫外修复相关基因进行定量分析发现：ΔMaDCT1中超氧化物歧化酶sod1和sod2，胶原蛋白基因Mcl2和几丁质合酶ChsV的表达量相较于野生型升高，这些基因可能与ΔMaDCT1对紫外抗性增强相关。
　　5.MaDCT对蝗绿僵菌毒力的影响
　　对东亚飞蝗五龄虫进行体表点滴和体内注射实验测定MaDCT对毒力的影响。实验结果表明：MaDCT1基因的缺失使蝗绿僵菌体表点滴毒力增强，ΔMaDCT1的LT50为7.5±0.2天，WT的LT50为8.2±0.15天，半致死时间提前约0.7d。体内注射对毒力无影响；MaDCT2基因缺失以及双敲除菌株对蝗绿僵菌的毒力并无影响。
　　6.MaDCT1转录组分析
　　通过对ΔMaDCT1在SYA培养基上12h的产孢时期样品进行转录组分析发现，野生型与ΔMaDCT1菌株间共有319个上调基因，165个下调基因。这些基因主要与产孢、生长、抗逆以及毒力相关。包含产孢相关基因19个，紫外抗性相关基因22个，毒力相关基因68个，碳代谢相关基因28个和转录因子19个。对差异基因进行GO功能分析，差异表达基因主要富集在细胞和膜组分，催化活力和结合力。KEGG Pathway富集发现差异表达基因主要集中在碳水化合物代谢，氨基酸代谢，转运和分解代谢以及信号转导。表明MaDCT1通过调控细胞代谢与产孢相关基因的表达来调控蝗绿僵菌产孢模式的转换。
　　综上所述，MaDCT基因在蝗绿僵菌生长及产孢过程、对逆境的敏感性、侵染致病过程以及产孢模式转换过程具有十分重要的作用。