恶性肿瘤是威胁人类健康最严重的疾病之一,居发展中国家致死率首位,抗癌形势严峻。由于肿瘤发生机制的复杂性和治疗的困难性,联合用药应运而生并成为当前临床癌症治疗中最重要的手段之一。联合用药能够发挥药物治疗协同作用、提高肿瘤治疗效果并降低毒副作用。在联合用药中,选择两种或两种以上具有协同作用的药物是治疗成功的关键。将生物活性分子与化疗药物联用可在不增加毒副作用的基础上提高药物疗效,在联合抗肿瘤中显示出巨大发展潜力及应用前景。在众多生物活性分子中,神经酰胺(Ceramide, CE)作为一种新型生物活性分子引起广泛关注。CE是人体自身存在的一类鞘磷脂,能介导细胞的生长、分化、凋亡等一系列生理活动,同时能够提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,具有良好的联合抗肿瘤应用潜力。然而,目前尚没有CE与抗肿瘤药物协同作用的系统性研究,因此,基于CE的联合抗肿瘤方法具有巨大的研究意义和应用前景。本课题旨在探索基于CE的联合抗肿瘤方案,确定CE与临床常用抗肿瘤药物多西他赛(Docetaxel, DTX)联用产生协同作用的机制；开发一种共递送CE和DTX的新型"two in one"脂质纳米混悬剂(Lipid based nanosuspension, LNS)体系,提高CE和DTX溶解度以及二者共递送效率,协同提高CE和DTX的抗肿瘤作用,利于未来癌症的治疗。研究内容与结果如下：1.基于神经酰胺的联合抗肿瘤方案筛选为更大程度上探索CE与化疗药物联用的潜力,本部分通过噻哗兰比色法(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)首次系统考察了CE与临床上广泛应用的三种化疗药物：DTX、紫杉醇(Paclitaxel, PTX)和多柔比星(Doxorubicin, DOX)联用后在四种常见肿瘤细胞：黑色素瘤细胞(B16)、卵巢癌细胞(SKOV3)、乳腺癌细胞(MCF-7)和肝癌细胞(HepG2)中的细胞毒性；通过联用指数(Combination Index, CI)法评价联用药物间的协同性,筛选出与CE联用的最佳化疗药物并对联用方案进行优化。实验结果表明,联合用药组与单独给药组相比,能显著性提高药物的细胞毒性(p<0.01)；CE与DTX在B16和MCF-7细胞上的联用指数最低(B16:CI=0.47; MCF-7:CI=0.71),具有最强协同作用；联用比例对药物间协同作用影响较大,当CE与DTX以摩尔比例0.5：1给药时可获得最低CI值(B16:CI=0.31; MCF-7:CI=0.48);给药顺序对协同作用无明显影响,适合同时给药。综上,当CE和DTX以摩尔比0.5：1同时给药时,在B16和MCF-7细胞上可获得最强协同效果,为最佳联用方案。2.神经酰胺-多西他赛协同抗肿瘤机制研究CE和DTX协同机制尚无任何报道,为更好的验证CE联用DTX(CE+DTX)的协同作用,为CE+DTX联用方案提供科学的理论基础,本部分分别从细胞凋亡,Caspase-3活性的激活,细胞周期阻滞和细胞骨架破坏四个方面探索CE和DTX产生协同杀伤肿瘤细胞的作用机制。在机制阐明基础上,通过小鼠黑色素瘤(B16)荷瘤小鼠考察CE+DTX体内药效,评价其体内协同抗肿瘤效果。实验结果表明,CE可靶向破坏细胞骨架中的微丝结构,促进微丝聚合和Caspase-3释放；DTX则可靶向破坏细胞骨架中的微管结构,促进微管聚合并抑制解聚；与单独用药组相比,CE+DTX可协同性破坏整体细胞骨架,最终使细胞凋亡比例、有丝分裂中G2/M期细胞比例均显著性升高(p<0.01)。该发现为CE和DTX的联用提供了良好的理论基础,有利于对CE+DTX进行深入研究。体内药效实验发现,CE+DTX组肿瘤抑瘤率高达64.92+0.22%,显著性高于CE组肿瘤抑瘤率(7.07+3.07%,p<0.01)和DTX组肿瘤抑瘤率(46.14±4.27%,p<0.01),表明CE+DTX共同给药在荷瘤小鼠体内具有良好协同抑瘤效果,为CE+DTX联合应用奠定了理论和实验基础。3.神经酰胺-多西他赛脂质纳米混悬剂药物含量测定方法建立采用高效液相色谱法(HPLC)测定共载CE和DTX的脂质纳米混悬剂(CE+DTX-LNS)中DTX的含量,并对方法学进行研究。结果表明HPLC法简便快速、灵敏度高、专属性强,能准确测定DTX含量。采用荧光分光光度法测定4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑(NBD)荧光标记的CE+DTX-LNS中NBD-CE的含量,并对方法学进行研究。结果表明荧光分光光度法灵敏度极高、选择性好、操作简便能准确测定CE含量。4.神经酰胺-多西他赛脂质纳米混悬剂协同抗肿瘤研究CE和DTX水溶性均较差,严重限制了其体内应用。CE尚无上市制剂,而目前上市的DTX剂型如多帕菲(?)和泰索帝(?),含有Tween-80和乙醇等助溶剂易导致超敏反应、肾毒性等不良作用。因此本课题采用高压均质法制备安全无毒的CE+DTX-LNS,采用冷冻干燥技术制备CE+DTX-LNS冻干制剂；透射电镜观察粒子外观形态,激光粒度分布与电势分析仪考察其粒径和电位；动态膜透析法考察体外释药行为；MTT法和Caspase-3活性检测法考察CE+DTX-LNS体外协同杀伤肿瘤细胞作用；小动物活体成像技术考察CE+DTX-LNS的体内分布；荧光倒置显微镜和流式分析仪评价课题制备的’two in one"LNS体系(CE+DTX-LNS)在共递送CE和DTX至同一肿瘤细胞中的优势；通过B16荷瘤小鼠验证体内协同抗肿瘤疗效,并考察协同抗肿瘤作用与共递送效率之间关系。实验结果发现,通过最佳处方和制备工艺制得的CE+DTX-LNS形态呈规则圆形,粒径为108.1±3.42nm,电位为-23.25±0.49mV,平均载药量为11.32±0.11%；制成冻干制剂后稳定性得到大幅提升,可在4℃条件下稳定储存3个月；CE+DTX-LNS具有良好缓释功能,且CE和DTX的释放相互独立；与CE(或DTX)溶液组相比,CE-LNS(或DTX-LNS)的细胞毒性显著增强(p<0.01),说明LNS能显著提高CE或DTX的递送效率；CE+DTX-LNS体外激活Caspase-3活性能力显著强于CE-LNS (p<0.01)和DTX-LNS (p<0.01),证明其具有协同诱导细胞凋亡能力；体外共递送实验中,CE+DTX-LNS能够将CE和DTX高效递送至同一肿瘤细胞,CE、DTX和细胞共定位良好,而经CE-LNS和DTX-LNS的物理混合物(CE-LNS+DTX-LNS)处理后,细胞分群现象明显,说明CE和DTX共递送效率差；CE+DTX-LNS与CE-LNS+DTX-LNS的细胞摄取均呈时间依赖性,其中CE+DTX-LNS最高摄取率为72.6+4.2%,显著高于CE-LNS+DTX-LNS的64.5+2.7%(p<0.05),说明"two in one" LNS体系中CE能够促进载体与细胞膜相互作用,增强载体摄取能力；小动物活体成像实验表明,CE+DTX-LNS与溶液组相比能够有效延长体内循环时间并被动靶向递送至肿瘤组织,减少正常组织分布；体内药效实验中,CE+DTX-LNS抑瘤率高达93.94+2.77%,显著高于单独给药的CE-LNS(33.22±5.43%, p<0.01)和DTX-LNS(69.32±3.65%,p<0.01)以及市售多帕菲(?)(59.91±4.54%,p<0.01),证明了CE+DTX-LNS体内良好的协同抑瘤效果；同时显著高于CE-LNS+DTX-LNS抑瘤率(84.94±3.76%,p<0.05),说明CE和DTX共递送至同一肿瘤细胞是发挥该协同抗肿瘤作用的基础。综上所述,本研究首次系统考察了CE与不同抗肿瘤药物的联用方案,弥补了该领域研究数据不足的缺陷；首次探索了CE联用DTX产生协同作用的机制,为CE+DTX联用方案奠定了良好的理论基础和实验基础；制备的CE+DTX-LNS是一种高效共递送CE和DTX的新剂型,能协同性提高体内抗肿瘤效果,减少给药剂量,降低毒副作用,是一种极有临床应用前景的联合抗肿瘤新剂型。