研究目的:基于自噬与外泌体,探究槲皮素对酒精性肝病（Alcoholic liver disease,ALD）的保护效应,并进一步探讨槲皮素调节自噬和外泌体的可能机制。研究方法:1、建立ALD模型并观察槲皮素干预效果:将70只8-9周SPF级健康成年雌性C57BL/6N小鼠随机分为4组,分别为对照组（CT）、酒精组（ET）、酒精槲皮素组（EQ）和槲皮素组（Q）。参考NIAAA模型并根据课题组前期研究,建立慢加急酒精喂养动物模型。酒精组以含5%（vol/vol）乙醇的Lieber-De Carli饲料喂养12周,于最后一天上午7至9点采用含5%（vol/vol）乙醇的生理盐水灌胃,对照组灌胃等能量的麦芽糊精。EQ及Q组槲皮素的剂量为100 mg/kg.bw,9小时后,处死小鼠并留取血液和肝脏等标本并进行血清学以及组织病理学检测,模型建立采取等能量配对喂养进行。2、槲皮素调节自噬以及外泌体从而改善ALD:采用Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3II/I以及p62的表达水平,使用免疫荧光技术对LC3与LAMP2进行共定位分析。通过亲水试剂的使用浓缩外泌体后低速离心收集小鼠血清外泌体。通过Western Blot检测外泌体标记蛋白TSG101和Alix,以及透射电镜观察其形态,验证提取方法的可靠性。进一步采用纳米粒子示踪技术对外泌体进行粒径和数量分析。提取肝脏总RNA并进行纯度检测后,构建文库完成质检,库检合格后的样品经Illumina平台完成测序得到转录组数据,再利用Uni Prot、KEGG和Metascape等对基因表达水平进行分析。研究结果:1、槲皮素缓解ALD:与对照组相比,酒精组小鼠体重明显下降（P<0.01）,肝脏重量增加（P<0.05）且肝体比明显上升（P<0.01）;与酒精组比较,酒精槲皮素组体重增加（P<0.05）,肝脏重量下降（P<0.01）且肝体比明显下降（P<0.01）。肝组织HE染色显示,对照组组织结构清晰,肝小叶结构完整,肝索排列整齐;酒精组小鼠肝组织结构紊乱,肝索结构出现明显的断裂现象,肝脏组织存在广泛的空泡且伴有炎性浸润;酒精槲皮素组相对酒精组结构清晰,空泡数量减少。油红染色显示酒精组肝组织脂滴明显增加,且存在许多较大的脂滴,酒精槲皮素组脂质沉积明显减轻。酒精组小鼠血清ALT、AST以及LDH水平明显升高（P<0.01）,酒精槲皮素组相对酒精组水平下降（P<0.01）。肝组织内IL-1β和IL-6等炎症因子m RNA水平明显增加（P<0.05）,而酒精槲皮素组HE染色未见明显炎性浸润,肝内IL-1β和IL-6的m RNA水平相对酒精组明显下降（P<0.01）。2、槲皮素拮抗酒精导致的自噬流抑制及外泌体释放增加:与正常对照组相比,酒精组自噬水平显著下降,表现为p62的堆积（P<0.05）和LC3II/I的下降（P<0.05）。槲皮素干预组相对酒精组自噬水平明显上升,表现为p62水平的下降（P<0.05）和LC3II/I的上升（P<0.01）。槲皮素干预能够有效缓解酒精导致的外泌体数量增加（P<0.05）,但不明显改变外泌体的粒径（P>0.05）。3、槲皮素可能通过恢复溶酶体功能调节自噬及外泌体以缓解ALD:转录组学结果显示,与正常对照组相比,酒精摄入导致自噬启动相关的基因如Atg2b等的上调,但抑制自噬小体与溶酶体融合降解相关基因如Hook2的表达,槲皮素拮抗酒精导致的自噬相关基因集的变化。酒精导致内吞途径及囊泡“货物分选”途径相关基因集的上调,槲皮素有效拮抗该效应。Western Blot检测溶酶体标记蛋白LAMP2、ATP6V1B2及active CTSB/CTSB,结果显示酒精摄入导致LAMP2和ATP6V1B2蛋白水平下降和active CTSB/CTSB下降,槲皮素有效拮抗该效应。结论:急慢性酒精摄入,导致小鼠出现明显肝脏损伤,主要表现为肝组织形态结构的紊乱、脂质沉积及炎症反应,槲皮素缓解上述ALD的表现。急慢性酒精摄入抑制小鼠肝脏的自噬,增加循环外泌体的数量,槲皮素可能通过改善溶酶体功能协调自噬以及外泌体释放从而减轻ALD。